本文要點：在近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-3000 nm）發(fā)射的熒光染料為血管和淋巴系統(tǒng)的實時和高分辨率成像提供了重大進展,。然而,，在體內(nèi)NIR-II追蹤標記細胞的課題仍然具有挑戰(zhàn)性。在這里,，我們開發(fā)了一種屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）NIR-II熒光團（FE-4ZW）,，帶有兩性離子末端基團，用于高效細胞標記,，而無需使用細胞穿透肽,，從而增強了細胞遷移位置的非侵入性體內(nèi)測定。拴系末端磺基銨內(nèi)鹽具有對細胞膜的高親和力,，因此即使對于固定細胞也能實現(xiàn)穩(wěn)定的標記,。移植干細胞的命運和腫瘤細胞在腦或外周組織中沿淋巴系統(tǒng)的遷移由細胞內(nèi)化的FE-4ZW清楚地監(jiān)測。本文還證實，臨床使用的表面活性劑D-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯可以減少肝臟和脾臟對FE-4ZW的攝取,。本文報道的熒光團設(shè)計策略和細胞標記技術(shù)為細胞遷移的可視化和對重新定位過程的洞察開辟了一個新的領(lǐng)域,，從而最終為更詳細地研究干細胞治療和腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機制提供了機會。

動物活體成像

方案1. FE-4ZW作為細胞示蹤劑的制造和體內(nèi)跟蹤血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)中細胞遷移的圖示

本文研究了FE-4ZW和FE-2PEG在單獨靜脈給藥后的體內(nèi)藥代動力學,。與循環(huán)時間長且具有部分腎排泄特征的FE-2PEG相比,，F(xiàn)E-4ZW在短血循環(huán)時間（～50分鐘）內(nèi)在肝臟和脾臟中積累更快。隨后,，肝臟和脾臟中的熒光信號強度隨著時間的推移而增加,，逐漸降低（圖1A-C和S13）?；贔E-4ZW與FE-2PEG相比更快的肝臟攝取特征,，我們假設(shè)當FE-4ZW注射到小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中時，它們也被肝細胞和/或巨噬細胞（Kupffer細胞）內(nèi)吞,。這種發(fā)現(xiàn)的差異初步表明,，與FE-2PEG相比，F(xiàn)E-4ZW具有更快的積累速率,，從而表明FE-4ZW可能與細胞膜具有更強的相互作用,，因此有可能作為更好的細胞造影劑。因此,，我們設(shè)計了廣泛的體外和/或體內(nèi)實驗來測量FE-4ZW作為細胞造影劑的能力,。

圖1. FE熒光團提供有效的第二近紅外（NIR-II）熒光成像對比度水平的能力

由于FE-4ZW與細胞膜之間存在潛在的相互作用和/或親和力，我們的方案不要求使用CPP,，因此在獲得熒光細胞方面更加簡化和直接（圖1D-F）,。利用幾種類型的細胞系,，包括肝臟、巨噬細胞,、干細胞和腫瘤細胞來評估 FE 熒光團系列,。在FE-4ZW與不同細胞系共孵育的整個過程中，F(xiàn)E-4ZW標記細胞的NIR-II熒光強度隨時間增加,，其中在12小時時間點有足夠的標記密度允許明亮的NIR-II成像（圖1F和S5）,。對于所有測試的細胞系，F(xiàn)E-4ZW的明亮NIR-II熒光信號允許在內(nèi)化時明確地勾勒出細胞形狀（圖1E,，F(xiàn)和S5）,。

圖2. FE-4ZW作為一種高性能細胞標記染料

相比之下，在 L-O2 細胞組中,，當它們與 FE-2PEG 或 FE-2PEG2ZW 熒光團一起孵育時,，獲得了非常低的熒光強度。這些結(jié)果表明,，分子結(jié)構(gòu)在作為高效細胞標記生物技術(shù)的作用中起著重要作用（圖2A,，B）。FE-4ZW的細胞內(nèi)光穩(wěn)定性也是通過將標記的L-O2細胞置于連續(xù)激光照射下來確定的（圖2C）,。熒光信號僅在2小時的時間過程中以極慢的速率衰減,。總的來說,，F(xiàn)E-4ZW是一種理想的細胞成像劑,，具有明亮的細胞內(nèi)NIR-II熒光發(fā)射和優(yōu)異的光穩(wěn)定性。FE-4ZW為非侵入性跟蹤體內(nèi)細胞命運奠定了基礎(chǔ),。

在細胞中使用FE-4ZW孵育12小時后,，用新鮮培養(yǎng)基替換含有未內(nèi)化FE-4ZW的細胞培養(yǎng)基。將標記的細胞順序培養(yǎng)長達 7 天,，每天收集上清液并通過 NIR-II 檢測器成像,。所有收集的上清液均未觀察到可檢測到的 NIR-II 信號，而細胞本身表現(xiàn)出明亮的 NIR-II 熒光信號,，這表明標記細胞中細胞內(nèi) FE-4ZW 染料的穩(wěn)定內(nèi)化（圖 2E,、F）。另一個補充需求是體內(nèi)細胞追蹤,，即使在主要標記信號顯示細胞增殖過程中耗盡后,，也能充分檢測增殖的細胞。即使細胞計數(shù)呈指數(shù)增長（經(jīng)CCK8測定證實）,，穩(wěn)定的NIR-II熒光信號仍可檢測到長達6天（圖2G-I）,。上述結(jié)果表明，F(xiàn)E-4ZW在細胞中的標記和/或內(nèi)化可以維持很長時間，從而為利用高對比度NIR-II熒光生物成像在細胞水平上監(jiān)測復雜的生理過程提供了機會,。

圖3. 通過使用 FE-4ZW 進行第二次近紅外 （NIR-II） 熒光成像來跟蹤移植神經(jīng)干細胞 （NSC） 的位置

通過用 FE-4ZW 預(yù)培養(yǎng) NSC 來證明活體 NSC 跟蹤,，然后靜脈注射標記的 NSC。根據(jù)既定方案,，通過離心仔細收集FE-4ZW標記的發(fā)光NSC,，隨后靜脈內(nèi)移植到Balb / C小鼠模型的血液循環(huán)系統(tǒng)中（圖3A）。NIR-II熒光信號在立即觀察時提供了清晰的肺部輪廓,，從而揭示了標記的NSC首先在肺部積聚,。這一結(jié)果與之前關(guān)于間充質(zhì)干細胞監(jiān)測的報道一致。肺內(nèi)FE-4ZW標記的NSC的NIR-II熒光信號隨著時間的推移逐漸減少,，并在72小時時間點后幾乎消失,。在整個實驗過程中，肝臟中的NIR-II熒光信號逐漸增加,。這些結(jié)果證實,，靜脈注射后移植的NSC在肺部初始積累后逐漸轉(zhuǎn)運到肝臟（圖3B-E）。通過跟蹤NSCs進行縱向?qū)崟r體內(nèi)成像,，可為臨床NSC治療的生理機制和障礙的檢測提供便捷的細胞跟蹤技術(shù)。

監(jiān)測腫瘤細胞在體內(nèi)的命運對于研究潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要,，但目前的非侵入性策略未能實現(xiàn)這一目標,。皮內(nèi)注射FE-4ZW標記的4T1腫瘤細胞，并觀察到腫瘤細胞（或細胞聚集簇）隨著時間的推移沿著淋巴管遷移（圖3F）,，從而最終接種在相鄰的淋巴結(jié)中（圖3G,，H）。通過體外泄漏實驗和細胞增殖實驗來測試FE-4ZW的細胞內(nèi)穩(wěn)定性,。結(jié)果表明,，在細胞內(nèi)化后，F(xiàn)E-4ZW可以穩(wěn)定地存在于細胞區(qū)室中（圖2D-I）,。此外,，體內(nèi)NSC細胞追蹤結(jié)果顯示，F(xiàn)E-4ZW標記的NSCs在肺內(nèi)停留了很長時間,，并逐漸循環(huán)到肝臟,。這表明內(nèi)部化的FE-4ZW沒有與NSC分離。如果FE-4ZW從細胞中分離出來,，肺的輪廓將迅速消失（圖3B,，D）。圖3F中沿淋巴管自由移動的熒光點的存在表明細胞聚集簇沿著淋巴管運輸,，而不是FE-4ZW染料自由移動,。本文報道的方法可能適用于監(jiān)測腫瘤細胞的命運和遷移途徑，從而可以識別腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵參數(shù)。