圖3. PTT -CDT體外細(xì)胞殺傷及 ICD 指標(biāo)的表達(dá)

如圖 3D所示，與其他制劑相比,，用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L處理的 143b 和 b 細(xì)胞?介導(dǎo)了 CRT,，這與細(xì)胞內(nèi) ROS 擴(kuò)增結(jié)果一致。此外,，該組中還顯示出 HMGB1 信號減弱,，CRT 水平的這種相反趨勢進(jìn)一步證明了我們的納米平臺增強(qiáng)的 ICD 效應(yīng)（圖 3D）,。隨后,，為了進(jìn)一步說明 ICD 相關(guān)蛋白的表達(dá)，通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了各種處理后 143b 中的 CRT 和 HMGB1 水平,。顯然,，當(dāng)用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2 + L 處理 143b 細(xì)胞時(shí)，CRT 在細(xì)胞膜上顯著上調(diào),，而 HMGB1 在細(xì)胞質(zhì)中顯著下調(diào)?（圖 3E ,、F）,。與mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中上述表達(dá)的蛋白質(zhì)水平分別大約高出 2 倍和降低 5 倍?（圖 3I,、J）,，揭示了該處理強(qiáng)大的 ICD激發(fā)能力。最后,，分別用CLSM和流式細(xì)胞儀獲得活死染色圖像和細(xì)胞凋亡-壞死研究,。與細(xì)胞內(nèi)ROS生成和HMGB1的結(jié)果類似，143b細(xì)胞在mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中經(jīng)歷細(xì)胞死亡?（圖 3K -N）,。正如預(yù)期的那樣,，當(dāng)mCu&Ce@ICG/RGD的濃度增加到300µg / mL時(shí)，H2O2預(yù)孵育加激光照射組中143b細(xì)胞的細(xì)胞活力僅為純納米平臺處理組的一半,。這種腫瘤細(xì)胞殺傷力主要由PTT同時(shí)擴(kuò)增的ROS和ICD介導(dǎo),。

圖4. 通過熒光成像、MRI 和光熱評估進(jìn)行體內(nèi)腫瘤靶向性評估

之后,，研究mCu&Ce@ICG/RGD在骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中的生物分布和腫瘤富集行為,。首先，為了獲得準(zhǔn)確的腫瘤輪廓辨別,，將mCu@ICG/RGD和mCu&Ce@ICG/RGD分別靜脈注射到荷瘤小鼠皮下,，隨后在特定時(shí)間拍攝NIR-II熒光生物圖像，通過小動(dòng)物NIR-II熒光成像生物系統(tǒng)監(jiān)測該納米平臺在體內(nèi)的腫瘤靶向性和生物分布,。顯然,，在注射mCu&Ce@ICG/RGD后2 h，腫瘤輪廓逐漸清晰,，熒光信號（超過1000 nm）最初集中在腫瘤部位,，腫瘤輪廓與周圍外周肌肉組織明顯區(qū)分開來；隨后,，它隨著時(shí)間的推移而緩慢衰減,，殘留納米平臺保持在48小時(shí)（圖 4 A）。而mCu@ICG/RGD的熒光信號主要分散在肝臟中,，并且在所有時(shí)間間隔內(nèi)都明顯高于mCu&Ce@ICG/RGD組,。基于在肝臟中的這種高積累,，后一組的腫瘤組織幾乎無法區(qū)分（圖 4 A）,。同時(shí)，收獲腫瘤和主要器官進(jìn)行離體NIR-II熒光生物成像,。值得注意的是,，即使可以看到上述兩組腫瘤中的比較光信號強(qiáng)度，mCu&Ce@ICG/RGD處理的肝臟的強(qiáng)度明顯低于mCu@ICG/RGD（圖 4 B）。此處,，前者相對快速的生物降解行為有利于肝臟清除,。因此，腫瘤與周圍正常組織的比例通過半定量平均NIR-II信號強(qiáng)度來計(jì)算,。mCu&Ce@ICG/RGD 在注射后 24 小時(shí)的數(shù)值比 mCu@ICG/RGD 高 6 倍（圖 4D）,。此外，本文還通過MRI 驗(yàn)證了Cu 基納米平臺對腫瘤的特異性識別,，以臨床Gd-DTPA 為對照,。根據(jù)不同時(shí)間間隔的連續(xù) T1WI MRI 生物圖像，足底注射 mCu&Ce@ICG/RGD 的淋巴轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的 MRI 信號在注射后 24 小時(shí)急劇增加至峰值水平,，從此時(shí)間點(diǎn)開始逐漸衰減至基礎(chǔ)強(qiáng)度（圖 4C）,。然而，由于 Gd-DTPA 的快速排泄,，可以在注射后 2 小時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤積累,。我們的納米平臺在 24 小時(shí)的腫瘤與組織比明顯高于 Gd-DTPA（圖 4E），進(jìn)一步證明了mCu&Ce@ICG/RGD有效的腫瘤靶向能力,，此時(shí)最合適進(jìn)行激光照射進(jìn)行PTT,。最后，研究了皮下骨肉瘤小鼠尾靜脈注射PBS,、mCu&Ce@ICG和mCu&Ce@ICG/RGD后在體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效果,。具體而言，納米制劑處理的腫瘤部位溫度急劇變化,，升高到峰值（分別為48.9和52.8°C）,，并且光熱維持率（圖 4F，G）,。毫無疑問,，這種現(xiàn)象主要?dú)w因于RGD修飾的主動(dòng)靶向能力。對于PBS處理的小鼠,，即使經(jīng)過300秒的照射,，溫度也僅略有升高（39.8°C）（圖 4F，G）,。因此,，上述體內(nèi)生物成像結(jié)果凸顯了多模對比納米劑在腫瘤診斷方面的潛力和令人滿意的腫瘤抑制熱療性能。

圖5.  體內(nèi) PTT CDT 和 ICD 評估

參考文獻(xiàn)

heng, M., Kong, Q., Tian, Q. et al. Osteosarcoma-targeted Cu and Ce based oxide nanoplatform for NIR-II fluorescence/magnetic resonance dual-mode imaging and ros cascade amplification along with immunotherapy. J Nanobiotechnol 22, 151 (2024).