引言：結(jié)直腸癌是目前世界shang第三致命的癌癥。與傳統(tǒng)的寬光篩查內(nèi)窺鏡檢查相比,，基于分子探針的近紅外-II (NIR-II)熒光成像能夠有效識別病變靶點,，提高圖像對比度，提高早期腫瘤檢出率,。c-Met在CRC晚期過度表達,，是一種腫瘤生物標志物。在此,，基于克唑替尼（Crizotinib）對c-Met陽性腫瘤細胞的良好靶向抑制作用,，染料IR808與藥物分子Crizotinib共價結(jié)合，從而合成了靶向c-Met陽性腫瘤細胞的近紅外熒光探針Crizotinib-IR808,。然后,，水不溶性Crizotinib-IR808與具有生物相容性和生物安全性良好的牛血清白蛋白納米粒子(BSA NPs)制備了 Crizotinib-IR808@BSA NPs。Crizotinib-IR808@BSA NPs具有腫瘤靶向能力,，可用于無chuang生物醫(yī)學血管NIR-II成像和術(shù)中實時NIR-II成像,，以指導腫瘤切除。在808 nm激光照射下,，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs對腫瘤表現(xiàn)出協(xié)同光療效應,。總之,，這種創(chuàng)新的影像介導的多功能聯(lián)合治療策略具有良好的c-Met靶向能力,，可能成為一種新的治療結(jié)直腸癌的方法。

研究內(nèi)容：作者設(shè)計并合成一種Crizotinib-IR808偶合物,，以研究其在結(jié)直腸癌中的NIR-II成像引導的協(xié)同化學光療,。選擇Crizotinib的哌啶胺作為IR808的連接子，因為該區(qū)域暴露于與Crizotinib共結(jié)晶的c-Met晶體結(jié)構(gòu)中的溶劑區(qū)域,。根據(jù)預測,，該區(qū)域的化學變化對Crizotinib與c-Met 的ATP結(jié)合口袋中的關(guān)鍵殘基的相互作用幾乎沒有影響，從而保持了藥物-染料偶聯(lián)物的效力,。然后,，使用具有高穩(wěn)定性、非抗原性和生物安全性的牛血清白蛋白納米粒子制備Crizotinib-IR808 @ BSA NPs,。將制備的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于腫瘤NIR-II成像以及術(shù)中NIR-II成像引導的腫瘤切除,。此外,，還研究了Crizotinib-IR808 @ BSA NPs用于化療協(xié)同PDT和PTT的腫瘤消除。

圖1. Crizotinib-IR808@BSA的特性 (A) TEM圖像 (B)流體動力學粒徑和(C)ζ電勢,。(D) Crizotinib -IR808和Crizotinib -IR808@BSA的吸收光譜和(E)近紅外熒光發(fā)射光譜(6μm),。(F)在不同溶劑中的NIR-II熒光圖像。(G) Crizotinib-IR808與BSA的分子對接(PDB ID: 6QS9),。(H)Crizotinib-IR808在含有白蛋白結(jié)合位點I,、II、III和α1-羥基脂肪蛋白抑制劑的BSA水溶液中的歸一化發(fā)射強度,。

TEM圖像顯示,，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs呈球形，在水溶液中均勻分布,，直徑為128.8 ± 9.4 nm,。DLS實驗表明，平均水合直徑為156.3 nm,，與TEM的結(jié)果相符,。與BSA相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs的ζ電勢向正方向移動了-5.2mV,。紫外-可見吸收光譜顯示,，水中的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在778 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，與DMSO中的Crizotinib-IR808相似,，比水中的游離Crizotinib-IR808懸浮液的吸收峰更尖銳,。通過光穩(wěn)定性實驗得出Crizotinib-IR808@BSA NPs的光穩(wěn)定性強于Crizotinib-IR808，證明BSA NPs是防止Crizotinib-IR808在水中聚集或水解的有效方法,。使用先前報道的方法,，作者更詳細地評估了Crizotinib-IR808的BSA結(jié)合位點。白蛋白結(jié)合位點I,、II,、III和1-羥基糖脂蛋白的抑制劑分別是華法林、布洛芬,、地高xin和奎尼啶，發(fā)現(xiàn)華法林能夠顯著降低熒光,，表明對白蛋白Sudlow位點I具有高親和力,。

圖2. 體外光熱效應和ROS生成 (A)不同梯度濃度和(B)不同輻照強度下的實時紅外熱像圖和溫度變化曲線。(C)光熱轉(zhuǎn)換效率 (D)光熱穩(wěn)定性,。(E)用Crizotinib-IR808@BSA進行DPBF預培養(yǎng)的吸收光譜,。(F)在DMSO中用不同輻射強度的Crizotinib-IR808@BSA進行DPBF預培養(yǎng)的相對吸光度。

研究了Crizotinib-IR808@BSA NPs的光轉(zhuǎn)化能力,，得出其溫度升高與濃度和激光強度有關(guān),。與臨床常用的光敏劑ICG相比,，Crizotinib-IR808@BSA NPs有更好的PCE。為了研究光穩(wěn)定性,，通過五次激光ON/OFF加熱循環(huán),，Crizotinib-IR808@BSA NPs光熱性能幾乎不變。然后研究了 Crizotinib-IR808 和 1O2 探針 DPBF 混合物的紫外可見光譜,，以確定產(chǎn)生 ROS 的能力,。發(fā)現(xiàn)在 Crizotinib-IR808@BSA NPs 的存在下，DPBF 在 415nm波長處的吸收強度隨時間和激光功率的變化而下降,。鑒于這些發(fā)現(xiàn),，Crizotinib-IR808 @BSA NPs可能成為808 nm單波長激光協(xié)同PDT/PTT治療的候選藥物。

圖3. 體外協(xié)同抗腫瘤作用 (A) CT26 細胞中Crizotinib-IR808@BSA 與 Mito-Tracker Green的共聚焦顯微圖像,。(B) 使用或不使用激光照射的情況下,，用Crizotinib-IR808@BSA處理CT26細胞24 h的存活率。CT26細胞在不同處理組中的(C) DCFH-DA染色熒光圖像,、(D)Calcein AM/PI 染色熒光圖像和(E)膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI分析,。

接著，分析了在細胞水平的性能,。首先,，應用流式細胞術(shù)和CLSM研究CT26細胞對Crizotinib-IR808@BSA NPs的攝取。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，細胞攝取出現(xiàn)在前30 min內(nèi),，2 h后趨于穩(wěn)定。Crizotinib-IR808@BSA NPs 的紅色信號與Mito-track探針的綠色信號呈現(xiàn)出共定位,，表明它能夠在線粒體積累,。DCFH-DA是ROS檢測器，在IR808和Crizotinib-IR808 @ BSA NPs+激光組中觀察到綠色熒光,，表明它們可被激光激活誘導ROS生成,。使用Calcein AM/PI進行染色實驗，以識別活體（綠色）和死亡（紅色）的 CT26 細胞,，發(fā)現(xiàn)激光照射產(chǎn)生的光療與化療協(xié)同作用,，增加了Crizotinib- IR808@BSA NPs對癌細胞的毒性。

圖4. 體內(nèi)NIR-II熒光成像性能 (A)注射Crizotinib -IR808@BSA后不同時間點荷瘤小鼠的NIR-II熒光圖像和(B)腫瘤的熒光強度,。(C)Crizotinib-IR808@ BSA注射后24小時NIR-II成像下手術(shù)過程圖像,。(D)注射Crizotinib -IR808@BSA后主要器官及腫瘤熒光強度的離體熒光圖像和(E)半定量分析。

為了探究體內(nèi)腫瘤成像能力,，將Crizotinib-IR808 @ BSA NPs注射到CT26荷瘤小鼠中,，發(fā)現(xiàn)熒光亮度在24 h達到max值，72 h后減弱,。之后,，在NIR-II成像指導下對CT26荷瘤小鼠進行了腫瘤切除,，證明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs能夠正確指導腫瘤的切除。對切除的腫瘤和主要器官進行了離體NIR-II成像分析,，發(fā)現(xiàn)Crizotinib-IR808 @ BSA NPs對腫瘤具有高選擇性,，此外還在肝臟和腎臟中聚集，并且兩者的信號強度都隨著時間降低,，表明可能存在的排泄途徑,。

為了探究體內(nèi)光療抗腫瘤活性,，通過紅外溫度計跟蹤荷瘤小鼠的溫度波動,，發(fā)現(xiàn)Crizotinib-IR808 @ BSA NPs在體內(nèi)能維持接近50℃的溫度殺死腫瘤細胞，同時減輕在過高溫度(> 60°C)對正常組織的傷害,。進一步研究其協(xié)同光熱治療的抗癌效果,，在接受激光照射后，給予Crizotinib-IR808@BSA NPs的小鼠中的腫瘤顯著縮小且大部分消失,，腫瘤的相對體積和重量均有顯著降低,。各組之間的體重輕微增加且無顯著差異，這表明治療通常耐受良好,。染色實驗顯示與對照組(單獨使用PBS,、PBS +激光和Crizotinib-IR808@BSA NPs)相比，Crizotinib-IR808@BSA NPs +激光治療組的腫瘤細胞壞死/凋亡面積更大,。以上結(jié)果與體外實驗結(jié)果一致,，表明激光照射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs可與化療、PDT和PTT同時進行,，以抑制腫瘤,。

圖6. 體內(nèi)毒理學分析 (A)CT26荷瘤小鼠不同治療后血液生物標志物的血液生化測定。(B)不同治療組的主要器官代表性H&E染色圖像,。

為了探究Crizotinib-IR808@BSA NPs的毒性和藥代動力學,，對小鼠血液中的Crizotinib-IR808濃度進行實時半定量，得到其半衰期為24.23 min,。血試驗測量了紅細胞(RBC)的溶血率,，測定結(jié)果溶血率低于1%，表明Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有優(yōu)異的血液相容性,。通過血液生化分析進一步證實了使用Crizotinib-IR808 @ BSA NPs治療對肝、腎或心臟功能參數(shù)無影響,。此外,，注射Crizotinib-IR808 @ BSA NPs的健康小鼠的主要器官的H&E染色照片也顯示,，未對小鼠產(chǎn)生顯著毒性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn),，Crizotinib-IR808 @ BSA NPs具有較高的腫瘤靶向化療光療作用和較低的副作用發(fā)生率,。

總結(jié)與展望：作者設(shè)計的Crizotinib-IR808 @ BSA NPs已成功用于體內(nèi)NIR-II成像引導的化學光療。Crizotinib-IR808是由臨床應用藥物Crizotinib和近紅外熒光染料IR808共價結(jié)合而成,。Crizotinib-IR808的du特結(jié)構(gòu)賦予其c-Met靶向能力,、優(yōu)異的1O2生成效率和高光熱轉(zhuǎn)換效率，具有良好的體內(nèi)治療應用前景,。通過BSA封裝,，Crizotinib-IR808的光學穩(wěn)定性和水溶性得到改善，并且還顯著改善了結(jié)直腸癌中的特異性積聚,，從而更容易區(qū)分脈管系統(tǒng),、腫瘤和周圍邊界。除了提高小鼠壽命和消除腫瘤外,，這種治療方法在作者的研究中也顯示出相對最小的不良作用,。該生物相容性分子蛋白復合物治療探針具有高時空分辨率NIR-II成像模式和高效治療功能，有望用于腫瘤的精確檢測和高效治療,。

參考文獻

Hu, Z.; Li, R.; Cui, X.; Chen, Z., Albumin-Based Cyanine Crizotinib Conjugate Nanoparticles for NIR-II Imaging-Guided Synergistic Chemophototherapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2023, 15 (28), 33890-33902.

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