腎功能障礙在最初階段的癥狀非常隱蔽，但后期可能導致腎功能不全,、腎衰竭,，甚至死亡。據(jù)估計,，每年有300萬人患末期腎臟疾病,，死亡數(shù)超過百萬。因此,，早期實時監(jiān)測腎功能不全對開展保護性干預和預防腎臟疾病的發(fā)展具有重要價值,。

通過第二近紅外（NIR-II）熒光成像可以實現(xiàn)體內(nèi)腎功能障礙的實時監(jiān)測，對腎臟疾病的診斷和維護患者健康具有重要意義,。然而,，目前開發(fā)的腎臟可清除NIR-II熒光材料的光穩(wěn)定性差、量子產(chǎn)率低,、激發(fā)波長短（均位于NIR-I區(qū)域）,，導致相鄰生物組織中的背景信號高，腎臟成像的分辨率和信噪比低,，限制了其在腎臟疾病研究中的應用,。開發(fā)具有優(yōu)異光物理性質(zhì)的新型腎清除NIR-II發(fā)光材料十分具有挑戰(zhàn)性，但在該領(lǐng)域有巨大價值,。

本研究合成了具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射雙重功能的腎透明金納米團簇（gold nanoclusters, Au-NCs）,，具有深層組織穿透、高信號背景比和高量子產(chǎn)率等特點,。這些優(yōu)點使Au-NCs能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率熒光成像,，以及監(jiān)測腎缺血再灌注（Renal Ischemia Reperfusion, RIR）和單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral Uretera Obstruction, UUO）引起的腎功能障礙（方案1）。本研究為NIR-II熒光成像提供了新的候選材料，并為腎臟疾病的高分辨率和精確成像提供了有力的工具,。

方案1. 雙配體穩(wěn)定的Au NCs的示意圖和NIR-II窗口中腎臟功能障礙的熒光成像監(jiān)測,。

在本研究中，通過兩步反應在水相中合成了一系列雙配體穩(wěn)定的Au NCs,。Au-配體復合物是通過將HAuCl4與MHA和另一種配體（包括Cystm,、ME、DTT）混合,，并在堿性條件下用NaBH4還原而形成的,。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，雙配體穩(wěn)定的Au NCs是具有良好單分散性的超小球形顆粒（圖1a-d）,。雙配體Au NCs與單配體MHA-Au NCs的吸收和發(fā)射光譜存在明顯差異,，雙配體Au NCs在1000nm附近顯示出明顯的吸收峰（圖1e）；其NIR-II發(fā)光相較于單配體MHA-Au NCs增強了近16倍（圖1f-g）,。使用NIR-II熒光染料IR-26作為參考,，計算得MHA/Cystm-Au NCs、MHA/ME-Au NCs和MHA/DTT-Au NCs的QY分別為1.4%,、2.0%和1.7%,，明顯高于先前開發(fā)的腎可清除NIR-II熒光材料的值，說明Au-NCs作為腎透明熒光材料在生物成像應用中具有潛力,。

圖1. NIR-II熒光圖像,、TEM圖像和所制備的MHA-Au NCs（a）、MHA/Cystm-Au NCs（b）,、MHA/ME-Au NCs（c）和MHA/DTT-Au NCs（d）的尺寸分布,。（e）Au NCs的紫外-可見-近紅外吸收光譜。（f）Au NCs的熒光發(fā)射光譜,。（g）Au NCs的發(fā)光強度的比較,。

作者以MHA/Cystm-Au NCs為模型，在水中使用1% Intralipid模擬生物軟組織進行成像,，進一步評估了它們的NIR-II熒光成像的穿透深度,、分辨率和SBR。發(fā)現(xiàn)穿透深度隨著激發(fā)波長增加而增加（圖2a）,，1064nm激發(fā)下檢測到的熒光信號高于980和808 nm激發(fā)下的熒光信號,，且熒光強度因材料厚度增加而降低的程度明顯更小（圖2b-c）,。隨著激光和濾光片波長的增加,，SBR不斷增加，毛細管半峰全寬逐漸減?。▓D2d,，e）,。這些結(jié)果表明，采用長波長激發(fā)可以提高NIR-II成像的穿透深度,、分辨率和SBR,，也進一步證明了雙配體穩(wěn)定的Au NCs用于生物成像的潛力。

圖2. （a）在不同激發(fā)（808,、980和1064nm）下,，用浸入1% Intralipid中的MHA/Cystm-Au NCs溶液填充的毛細管的熒光圖像。（b）來自（a）的沿著黃色箭頭的橫截面熒光強度分布,。（c）MHA/Cystm-Au NCs在不同厚度（3,、5和7mm）的Intralipid和不同激發(fā)激光下的熒光信號強度。（d）用不同的激發(fā)激光器和過濾器（2mm 1% Intralipid下）對填充有MHA/Cystm-Au NCs溶液的毛細管進行NIR-II熒光成像,。（e）截面熒光強度分布圖（黑色）和沿（d）中黃線的高斯擬合線（紅色）。

接著作者進行了體內(nèi)熒光成像研究,，通過小鼠尾靜脈注射ICG,、MHA-Au NCs和雙配體Au NCs，在1064nm的激發(fā)下于NIR-II窗口中成像,，探究所合成的Au NCs在腎臟中的成像性能,。如圖3a所示，注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘,，腎臟即被清晰區(qū)分,，并且沒有觀察到來自鄰近組織的明顯干擾信號。隨著MHA/Cystm-Au NCs從腎臟中清除,，腎臟區(qū)域的熒光強度逐漸降低,，接著Au NCs通過輸尿管進入膀胱，在10分鐘時可觀察到膀胱區(qū)域的熒光信號,，并在注射后3小時達到max值,。隨后，Au NCs隨尿液排出體外,。值得注意的是,，MHA/Cystm-Au NCs的腎臟成像分辨率遠高于先前文獻中報道的分辨率，腎臟區(qū)域的SBR高達4.53（圖3b-c）,。與MHA/Cystm Au NC相比,，ICG和其他Au NCs對腎臟的成像能力相對較弱，SBR值相對較低,。這證明了MHA/Cystm-Au NCs具有良好的腎臟成像能力,。

圖3.（a）靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs后24小時內(nèi)KM小鼠的NIR-II熒光成像。（b）分別在靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs,、MHA/ME-Au NC,、MHA/DTT-Au NCs、ICG和MHA-Au NCs后5分鐘KM小鼠的NIR-II熒光成像。（c）來自（b）的沿著黃線的橫截面熒光強度分布（黑色）和高斯擬合線（紅色）,。

在上述研究的基礎(chǔ)上,，作者使用MHA/Cystm-Au NCs分別對RIR和UUO誘導的腎功能障礙進行成像，以評估其實際應用能力,。

RIR是腎臟疾病手術(shù)中的一種常見現(xiàn)象,，容易導致急性腎損傷，并有發(fā)展為終末期腎臟疾病,、帶來高死亡率的風險,。作者通過手術(shù)夾閉小鼠腎動脈和靜脈建立RIR小鼠模型。將兩個實驗組小鼠的左腎分別夾緊30和60分鐘,；假手術(shù)組在沒有夾腎的情況下進行了相同的手術(shù),，然后在術(shù)后15分鐘靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs，在注射后的不同時間點對小鼠進行成像（圖4a）,。成像結(jié)果如圖4b所示,。在假手術(shù)組小鼠中，左腎和右腎的熒光強度相當,，并具有相同的衰減趨勢（圖4c-d）,；對于缺血30分鐘的小鼠，左腎的熒光強度在5分鐘內(nèi)增加到峰值,，然后降低,，下降的速度比假手術(shù)組慢，左腎和右腎的熒光強度比逐漸增加到1.3,，這是由于缺血引起的左腎損傷,，導致腎臟清除緩慢；對于缺血60分鐘的小鼠,，左腎的熒光強度在注射后10分鐘達到max值,，隨后降低，與缺血30分鐘相比,，熒光強度下降的速度更慢,，左腎與右腎的熒光強度比逐漸增加到2.2，表明缺血腎的清除率進一步減慢,。這些結(jié)果表明,，腎缺血時間越長，腎臟在注射Au NCs后達到m熒光的時間越長以及左腎和右腎的熒光之間的差異越大,。隨著成像時間的增加,，缺血性腎臟的SBR逐漸高于非缺血性腎臟（圖4e）。

圖4. （a）RIR小鼠模型的構(gòu)建和RIR小鼠NIR-II熒光成像的時間線的示意圖,。（b）靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后RIR小鼠在不同時間點的NIR-II熒光成像,。（c） 注射MHA/Cystm-Au NCs后缺血腎臟熒光強度的變化（*p＜0.05,，**p＜0.01）。（d）RIR小鼠左腎和右腎的熒光強度比,。（e）SBR用于靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后不同時間點RIR小鼠缺血性腎臟的熒光成像,。

UUO法常用于腎間質(zhì)纖維化模型的制備。梗阻后,，尿液潴留壓迫腎小管,，導致腎小管上皮細胞進行性壞死，間質(zhì)急慢性炎細胞浸潤,，壞死的腎小管組織逐漸被纖維瘢痕取代,，最終形成進行性腎間質(zhì)纖維化。作者通過外科縫線完quan結(jié)扎小鼠左輸尿管建立UUO模型,。結(jié)扎一段時間后,，將MHA/Cystm-Au NCs靜脈注射到小鼠中，并在注射后的不同時間點進行NIR-II熒光成像（圖5a）,。如圖5b所示,，在注射后5分鐘檢測到腎臟中的NIR-II發(fā)光信號，并隨著時間的推移逐漸減弱,。在接受輸尿管結(jié)扎0分鐘和30分鐘的小鼠中，左腎和右腎的信號之間沒有觀察到明顯的差異,；在接受輸尿管結(jié)扎24小時的小鼠中,，左腎的熒光顯著低于右腎（圖5c），且左腎的SBR低于右腎的SBR（圖5d）,。表明輸尿管結(jié)扎24小時會導致腎濾過異常,，結(jié)扎30分鐘則無顯著影響。

此外,，作者還對兩組模型分別進行了H&E染色分析驗證腎損傷情況,。結(jié)果顯示，使用UUO模型的實驗中,，與假手術(shù)組的腎臟相比,，UUO 24小時后，腎臟腎小管輕度擴張,，腎小管上皮細胞少量壞死脫落,，證實了UUO 24 小時誘導的輕微腎損傷。而在使用RIR誘導的腎損傷模型的實驗中,，與未缺血的小鼠相比,，缺血60min的小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些明顯的損傷，表明60min的夾閉導致了嚴重的腎損傷,。該結(jié)果與熒光成像結(jié)果一致,，因為缺血60分鐘的小鼠觀察到蕞高熒光信號的時間晚于UUO 24小時的小鼠（圖4b, 5b）,。這說明所制備的Au-NCs能夠區(qū)分不同的腎損傷情況，驗證了Au-NCs對腎功能障礙成像的能力,。

圖5. （a）UUO小鼠模型的建立和NIR-II熒光成像的示意圖,。（b）輸尿管結(jié)扎0分鐘、30分鐘和24小時的UUO小鼠靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后的NIR-II熒光成像,。（c）沿圖中黃線的橫截面熒光強度圖,。（d）注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，不同結(jié)扎時間的UUO小鼠腎臟熒光成像的SBR,。

總之,，本研究成功合成了一系列具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射的雙配體穩(wěn)定的Au NCs，可用于體內(nèi)RIR和UUO誘導的腎功能障礙的高分辨率熒光成像,。與以往的腎功能NIR-II成像相比,，在NIR-II激發(fā)下的熒光成像可以更清晰地顯示腎臟，實現(xiàn)對腎功能障礙的更準確診斷,，為腎功能障礙的高分辨率精確成像提供了有力的工具,。

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