本文要點：基于小分子的第二近紅外 (NIR-II) 可激活熒光探針可以潛在地提供高目標背景比和深層組織穿透。然而,，由于缺乏通用且穩(wěn)定的光學可調(diào)基團,，大多數(shù)報道的 NIR-II 可激活小分子探針的通用性較差。在這項研究中,，作者設計了 NIRII-HD,，一種針對 NIR-II 探針開發(fā)進行優(yōu)化的新型染料支架。特別是,，染料 NIRII-HD5 表現(xiàn)出zui jia的光學特性,，如適當?shù)?pKa 值、出色的穩(wěn)定性和高 NIR-II亮度,，這有利于高對比度的體內(nèi)成像,。為了證明 NIRII-HD5 染料的適用性，設計了三種用于 ROS,、硫醇和酶的靶向激活 NIR-II探針,。使用這些新型探針，不僅在小鼠模型中實現(xiàn)了不同疾病的可靠 NIR-II 成像,，而且還以高保真度評估了體內(nèi)肝損傷期間肝組織的氧化還原電位,。

圖 1. a) 報告的已激活探針平臺 b) 新型活化探針平臺NIRII-HD染料的合理設計

圖 2. a) O-HD 和 NIRII-HD1 在 PBS 緩沖液中的歸一化吸收和發(fā)射光譜; b)50μM HClO 和 c) 5μM ONOO-的時間依賴性吸收光譜；d) 50μM HClO 和 e) 5μM ONOO- 的時間依賴性吸收光譜; f)NIRII-HD3 和g) NIRII-HD5 的歸一化吸光度與 λmax 處 pH 的對應圖,；h) ICG/O-HD (5μM) 和 NIRII-HD 染料（1-5 分別代表 NIRII-HD1-5）在 PBS（pH 7.4,，含有 30% EtOH 和 1% 吐溫）中的相對吸收 i) PBS 緩沖液中染料溶液的歸一化吸收

首先為了設計具有與 O-HD 相似性質(zhì)的 HD 類 NIR-II 染料需要：（1）增強 O-HD 的吲哚雜環(huán)部分的供體強度以延長其發(fā)射,， (2) 在 O-HD 的破壞位點引入封端基團以增加其穩(wěn)定性；(3) 降低 O-HD 或其類似物酚基的 pKa 值以增強其相應分子探針的響應性能在生理環(huán)境中,?；谶@些考慮，合成了新型 HD-like NIR-II 染料 NIRII-HD1-5,，并且評估了表現(xiàn)zui jia的染料NIRII-HD5 用于體內(nèi)成像的潛力,。MTT 測定并證明 NIRII-HD5 對細胞活力沒有顯著影響，然后,，在體內(nèi)評估 NIRII-HD5 的細胞毒性,，實驗組小鼠未出現(xiàn)任何器官損傷。

圖 3. a) 淋巴結(jié)成像示意圖 b) O-HD及其類似物（標記為1、2和3）和NIRII-HD5（標記為4）的結(jié)構(gòu)式 c) O-HD 及其類似物與 NIRII-HD5 在 NIR-I 或 NIR-II 熒光成像窗口對腘窩淋巴結(jié)的比較;使用 d) NIRII-HD5 和具有 (+)/不具有 (-) 激光照射和夾子阻斷的 ICG 在注射后的不同時間點拍攝的腘窩淋巴結(jié)的熒光圖像 e) 用 (+)/不用 (-) 激光照射的腘窩淋巴結(jié)的熒光強度信號與從圖 3d 獲得的時間作圖

其次,，探索了 NIRII-HD5 在活體深部組織成像方面的能力,，并將成像性能與 O-HD 的成像性能進行了比較。從活體成像中可以看到,，混合溶液皮內(nèi)注射后,，NIRII-HD5在NIR-II窗口（1000-1700 nm）有清晰的淋巴結(jié)成像，其SBR高達10.5 （圖 3a-3c）,。相比之下,，O-HD 及其兩種類似物在發(fā)射通道（695-770nm，NIR-I 區(qū)域）中顯示出弱熒光以及較差的信背比（SBR < 2.4）（圖 3c）,。這些結(jié)果表明,，O-HDs在活體小鼠淋巴結(jié)中的不良成像性能主要是由于NIR-I光的組織穿透力較弱和組織背景自發(fā)熒光較強，進一步證明了NIRIIHD5*的深部組織成像能力,。

如圖3d和3e所示,，860 nm激光照射5分鐘后，NIRII-HD5仍能清晰區(qū)分淋巴結(jié),，NIRII-HD5的熒光強度保持不變,。相比之下，ICG 在相同通量率下用 808 nm 激光激發(fā) 5 分鐘后大部分褪色,，僅保留初始發(fā)射強度的 30%,。結(jié)果表明 NIRII-HD5 具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，這將有利于長時間的體內(nèi)成像,。此外,，值得注意的是，腘窩淋巴結(jié)的ICG信號在照射后5分鐘即可恢復,，說明小鼠的淋巴管未受損,，因此富集在小鼠足底的ICG染料可以流到小鼠足底。淋巴結(jié)再次通過淋巴管（圖3d-3e）,。為了進一步證實這一點,，增加了一個實驗，在激光照射后用止血夾阻塞淋巴管,。結(jié)果顯示,，與未使用止血夾的對照組相比，ICG淋巴結(jié)信號的恢復明顯受到抑制（圖3d-3e）,。

圖 4. a) 分別用于 ONOO-,、GSH 和 ALP 檢測的三個探針的設計 b) NIRII-HD5-ONOO-(5μM), e) NIRIIHD5-GSH (5μM), h) NIRII-HD5-ALP (5μM) 分別響應生物標志物的歸一化吸收光譜 c）NIRII-HD5-ONOO-（5μM）響應ONOO（0-10μM）的熒光光譜 d) NIRII-HD5-ONOO- (5μM) 對各種分析物的熒光響應 f)NIRII-HD5-GSH (5μM) 響應 GSH (50–1400μM) 的熒光光譜 g) NIRII-HD5-GSH (5μM) 對各種分析物的熒光響應

接著，如圖 4a 所示,，基于 NIRII-HD5,，開發(fā)了三種可激活的 NIR-II熒光探針 NIRII-HD5-GSH,、NIRII-HD5-ONOO-和 NIRII-HD5ALP，用于檢測 GSH,、ONOO-和 ALP 活性,，選擇這三個成像目標是因為它們代表三種不同類型的分析物（ROS、硫醇和酶）,，同時在各種生物過程中也很重要,。選擇性實驗表明，NIRII-HD5-ONOO-對ONOO-表現(xiàn)出比其他生物物種高的選擇性（圖4d）,，表明它可以用作ONOO-檢測的有效熒光探針,。同樣,，探針 NIRIIHD5-GSH 也可以在 PBS 緩沖液中被 GSH 有效激活,。如圖 4e-4g 所示，在 1.4 mM GSH 存在下,，NIRII-HD5-GSH 在 895 nm 的峰值處表現(xiàn)出顯著的熒光增強,，而在添加其他生物物種后觀察到的變化可忽略不計。最后,，確定 NIRII-HD5-ALP 保留了其對 ALP 的響應性,。與探針 NIRII-HD5-ONOO- 和 NIRII-HD5GSH 類似，探針 NIRII-HD5-ALP 也顯示出 ALP 依賴性響應和優(yōu)異的選擇性（圖 4h ）,?？偟膩碚f，結(jié)果表明,，與原始染料 O-HD 相似,，新型染料 NIRII-HD5 可用作設計用于 NIR-II 傳感的可激活熒光探針的有效平臺。

圖 5. a) 使用 NIRII-HD5-ONOO- 探針（1：腘窩淋巴結(jié),；2：坐骨淋巴結(jié)）對 LPS 誘導的淋巴炎癥進行示意圖和 NIR-II熒光成像 b）隨時間推移,，從 LPS 處理/鹽水處理組獲得的腘（紅圈）和坐骨神經(jīng)（藍圈）淋巴結(jié)的熒光信號 c) 轉(zhuǎn)移性腫瘤誘導的前哨淋巴結(jié)的體內(nèi)成像 NIRII-HD5-GSH探針4T1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型建立及腫瘤側(cè)及正常側(cè)淋巴結(jié)熒光成像示意圖。d) 圖 5c 中隨時間從腫瘤側(cè)/正常側(cè)獲得的腘窩和坐骨淋巴結(jié)的熒光信號 e）正常側(cè)和腫瘤側(cè)淋巴結(jié)切片中CD206的免疫組織化學圖像

緊接著為了證明NIRII-HD5 衍生探針用于體內(nèi)熒光檢測的能力,，NIRII-HD5-ONOO- shou ci應用于檢測脂多糖 (LPS) 皮內(nèi)注射誘導的淋巴炎癥小鼠模型中的 ONOO-,。如圖5a所示，與生理鹽水處理的對照組相比,，LPS誘導的實驗組腘窩和坐骨淋巴結(jié)在NIRII-HD5-ONOO-給藥后均表現(xiàn)出明顯的亮度,。特別是，與對照組相比,，LPS 組中腘窩淋巴結(jié)的信號在注射探針后 30 分鐘后增加了2 倍（圖 5b）,。該結(jié)果表明LPS確實可以誘導淋巴結(jié)炎癥，探針NIRII-HD5-ONOO-可用于對該過程進行成像,。

為了進一步可視化和跟蹤淋巴實體瘤轉(zhuǎn)移,，通過GSH特異性反應探針檢測到淋巴管中GSH的波動,。因此如圖 5c 所示，當將 NIRII-HD5-GSH 注射到 4T1 荷瘤小鼠的左右后爪中時,，在腘窩和坐骨淋巴結(jié)中觀察到了耀眼的 NIR-II 熒光,。腫瘤側(cè)（右側(cè)），而小鼠正常側(cè)（左側(cè)）的淋巴結(jié)表現(xiàn)出弱熒光,。相比之下,，在正常小鼠（無荷瘤小鼠）兩側(cè)的淋巴結(jié)中檢測到幾乎相同的微弱熒光信號。量化平均強度顯示,，腫瘤側(cè)腘窩和坐骨淋巴結(jié)區(qū)域的信號比正常側(cè)高出3倍,，表明確實發(fā)生了癌細胞通過淋巴管的代謝遷移（圖5d）。這些結(jié)果證實,，源自NIRII-HD5 的新型 NIR-II 探針可用作體內(nèi)疾病診斷的有效工具,。

圖 6. a) APAP 誘導的肝損傷和 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 治療的示意圖 b) 分別通過探針 NIRII-HD5-GSH 和探針 NIRIIHD5-ONOO- 用鹽水、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的 NIR-II 圖像,， SBR 從圖 6b 中的 c) NIRII-HD5-GSH 和 d) NIRII-HD5-ONOO- 獲得 e) 用鹽水,、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的代表性組織學

APAP 在肝臟中進行酶促生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 N-乙酰基-對苯醌亞胺 (NAPQI),，該亞胺可被谷胱甘肽 (GSH) 迅速還原,。APAP過量后，過量產(chǎn)生的NAPQI會消耗GSH,，導致細胞蛋白直接結(jié)合,，導致線粒體功能受到干擾，釋放出大量ROS（如ONOO-）,，此外,，N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作為一種保肝藥物，可產(chǎn)生 GSH 來抵消 APAP 引起的肝臟氧化應激（圖 6a）,。最后檢查了 NIRII-HD5 探針（NIRII-HD5-GSH 和 NIRII-HD5-ONOO-）是否可以監(jiān)測這一過程體內(nèi)具有 NIR-II 成像,。如圖 6b 和 6c 所示，用鹽水處理的正常 Balb/c 小鼠在施用 NIRII-HD5-GSH 后在肝臟中顯示出高熒光,。在用 300 mg kg-1 APAP 預處理 12 小時后,，在小鼠肝臟中觀察到 NIR-II熒光顯著降低。相比之下,，探針NIRII-HD5-ONOO- 在藥物刺激前后小鼠肝臟中表現(xiàn)出相反的熒光變化（圖 6b 和 6d）,。這些結(jié)果表明，隨著藥物性肝毒性的發(fā)生,，小鼠肝臟中的GSH被消耗,，肝臟組織中的ROS（ONOO-）顯著增加。小鼠先用 300 mgkg-1 APAP 預處理誘導肝損傷,，然后用 NAC (600 mg kg-1) 治療,，與僅接受 APAP (300 mg kg-1) 的小鼠相比,，NIRIIHD5-的熒光顯著增強觀察到 GSH 和 NIRII-HD5-ONOO- 明顯減少。

參考文獻

Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Feb 25:e202201541. doi:10.1002/anie.202201541. Epub ahead of print. PMID: 35218130.

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