本文要點：前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發(fā)性和轉移性前列腺腫瘤細胞膜上過表達的一種II型跨膜糖蛋白,，PSMA的表達水平與前列腺癌分期和Gleason評分呈正相關,，因此,，PSMA可作為一種評估PCa（前列腺癌）的有效生物標志物。

現(xiàn)如今盡管已經(jīng)開發(fā)出幾種治療前列腺癌的藥物，前列腺切除術仍然是不錯的治療方法和早期患者可選擇的辦法，但是前列腺癌(PCa)由于其復雜的解剖結構,，在保留癌旁組織的同時對腫瘤進行精確切除是一個挑戰(zhàn)。前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發(fā)性和轉移性前列腺腫瘤細胞膜上過表達的一種II型跨膜糖蛋白,，PSMA的表達水平與前列腺癌分期和Gleason評分呈正相關,，因此，PSMA可作為一種評估PCa（前列腺癌）的有效生物標志物,。近年來已經(jīng)開發(fā)出了一些針對前列腺特異性膜抗原（PSMA）進行光學成像的探針,，如CY7-3、CY7-2和L16(圖1a),，它們在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的發(fā)射波長分別為767,、767和800 nm，這些探針存在著近紅外一區(qū)（NIR-I）探針固有的缺點,，例如穿透組織能力差,，分辨率有限。近紅外二區(qū) (NIR-II,，1000-1700 nm)成像自體熒光水平較低，光子散射小,，穿透能力強,、具有高時空分辨率和高靈敏度的特點，可以顯著提高成像質(zhì)量,，可用于腫瘤切除術中導航,。

作者在本文中設計、合成了一種帶有兩個前列腺特異性膜抗原(PSMA)結合基元的探針(PSMA-1092),，該探針具有優(yōu)異的光學性能(λmax= 1092 nm),，對PSMA具有超高親和力(Ki= 80 pM)。采用PSMA-1092探針進行小鼠NIR-II成像,，可以高分辨率顯現(xiàn)腫瘤(TNR= 7.62±1.05),，邊緣清晰,，然后，作者將PSMA-1092用于小鼠前列腺腫瘤切除術中導航,，在腫瘤切除過程中,，NIR-II成像可對肉眼檢查遺漏的殘余腫瘤進行實時成像檢測?？偟膩碚f,，PSMA-1092在描繪腫瘤邊緣和檢測殘余腫瘤方面表現(xiàn)良好，在臨床實踐中顯示了精確切除PCa腫瘤的潛力,。

圖1：(a)以前報告的PSMA熒光探針的結構,。藍色表示結合基序，紫色表示NIR-I區(qū)的熒光團,。(b)新設計的NIR-II PSMA探針的結構,。

考慮到供體-受體-供體(D−A−D)核心結構以及合適的電子受體和電子供體部分是獲得NIR-II近紅外二區(qū)熒光探針的關鍵因素，作者選擇苯二聯(lián)體(1,2,5-噻二唑)部分作為優(yōu)良的電子受體,。以兩個((S)5-氨基-1-羧基)氨基甲酰)- l -谷氨酸(Glu-urea-Lys)作為與PSMA特異性結合的基團,，通過酰胺鍵與熒光團部分結合，增強了探針與PSMA的親和力(圖1b),，此外,，Glu-urea-Lys基團上的三個羧基也使探針具有較強的親水性，顯著提高了探針在水溶液中的溶解度,，PSMA-1092探針的合成路線如下（方案1）,。

方案1：試劑和條件:(a)丙烯酸、乙酸(20% in H2O),，100℃,，隔夜，94.5%; (b)叔丁醇,、DCC,、DMAP、CH2Cl2,，室溫,，隔夜，43.2%;(c)六丁基二錫烷, Pd(PPh3)4,，甲苯,，N2, 120℃, 2 h;(d) 4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑，PdCl2(PPh3)2,，甲苯,，N2, 120℃,2 h, 7.7%;（e）鐵粉，醋酸，100℃,，30分鐘,，36.2%;(f) PhNSO, TMSCl，干吡啶,，80°C,，過夜，27.2%;(g) TFA, CH2Cl2,，室溫,，4 h;(h) 2,3,5,6-四氟苯酚，DCC, CH2Cl2,，室溫,，5 h, 67.4%;(i)二叔丁基(((S)-6-氨基-1-(叔丁基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酰)- l –谷氨酸，Et3N, CH2Cl2,，室溫,，6 h, 61.3%。

PSMA-1092探針由于D-A-D結構中強烈的分子內(nèi)電荷轉移(ICT)效應,，其熒光發(fā)射峰在1092 nm處測得(DMSO,，圖2a，b),，該峰位于近紅外二區(qū),，為了驗證PSMA-1092的光穩(wěn)定性，將其二甲基亞砜溶液暴露于激光(727nm,，10W)進行30分鐘的連續(xù)輻射,，沒有觀察到明顯的光降解(圖2c)，表明其出色的光穩(wěn)定性,。在PBS中測得PSMA-1092的量子產(chǎn)率為6.66%,，這對于近紅外二區(qū)成像來說是足夠高的。利用近紅外成像系統(tǒng),，在不同的濾光片下進一步比較了PSMA-1092在PBS中的近紅外熒光信號,。PSMA-1092溶液在1000和1200nm LP濾光片下可見，而在1300或1400納米濾光片下未檢測到信號(圖2d),?？紤]到在1000nmLP濾光片下的熒光信號比其他濾光片更強，選擇1000nmLP濾光片用于進一步的體內(nèi)近紅外二區(qū)成像,。總的來說,，該探針具有良好的熒光發(fā)射波長,、較大的Stokes位移和優(yōu)異的光穩(wěn)定性，在體內(nèi)NIR-II近紅外二區(qū)成像方面具有很大的潛力。

圖2：(a) PSMA-1092的光學特性,。在DMSO中吸收(λex1)和發(fā)射(λem1)波長,。PBS中測量的量子產(chǎn)量。在酸性水溶液(pH = 2.66)中測定吸收光譜(λex2)和發(fā)射光譜(λem2),。Ki（受體親和力指數(shù)）通過LNCaP細胞（人前列腺癌細胞）裂解液的抑制實驗測定,。Pka（結合常數(shù)）是根據(jù)Boltzmann曲線計算的。(b) PSMA-1092 (10 μM)在DMSO中的紫外-可見-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜,。(c) PSMA-1092 (10 μM)在727 nm連續(xù)激光照射DMSO中的光穩(wěn)定性,。(d) PSMA-1092 (0.43 mM)在PBS中與各種LP濾光片的NIR-II成像。白色虛線勾畫出了不可見的溶液,。

此外,，作者觀察到PSMA-1092的熒光性質(zhì)在不同pH值的溶液中發(fā)生了顯著變化(圖3a,b)，肉眼可以觀察到PSMA-1092溶液暴露在酸性溶液中,，在自然光下由青色變?yōu)榱练凵?圖3c),，在365 nm紫外光下(圖3d)或在NIR-I成像中(圖3e)可以觀察到熒光逐漸增加。熒光光譜顯示,，熒光極大值從1092 nm藍移至620 nm,且隨著溶液酸度的增加,，620nm處的熒光強度隨著溶液酸度的增加而大大提高(圖3a,b)，當溶液pH從7變到0.3時,，PSMA-1092溶液的熒光強度增加了85倍,。此外，PSMA-1092在620 nm處的熒光強度圖與pH值的Boltzmann曲線擬合良好(R2= 0.9984),，計算得到pKa為1.95(圖3b),。PSMA-1092的pH響應突出了其在更廣泛領域的應用潛力，比如在非侵入性測量胃液pH值時,，從NIR-II區(qū)域到NIR-I區(qū)域的巨大波長位移可以有效地避免原始波長的影響,，從而提高了檢測精度，進一步的pH響應應用作者仍在研究當中,。

為了進一步測試PSMA-1092的體內(nèi)性能,，我們使用皮下LNCaP（人前列腺癌細胞）荷瘤小鼠(n = 3)進行NIR-II成像,。尾靜脈注射PSMA-1092（劑量為2.5毫克/千克體重），在不同的時間點(1,、2,、4、6,、8,、12、24 h,圖4) （792nm激光激發(fā),，100 mW / cm2 功率密度 ）(1000 nmLP濾光片,50 ms曝光時間)進行NIR-II成像,。如圖4所示，PSMA -1092在注射后2小時內(nèi)在腫瘤及周圍組織中積累(圖4c),。注射后4小時,，腫瘤與周圍組織區(qū)別開來，具有良好的對比度(圖4d),，并且在隨后的時間點保持了高質(zhì)量圖像 (圖4e-h),，這表明成像性能優(yōu)異且在小鼠模型中具有高穩(wěn)定性。為了獲得更詳細的藥代動力學信息,，進行了基于近紅外圖像的腫瘤與正常組織比率(TNR)的半定量分析,。由于PSMA-1092在正常組織中的清除速率快于在腫瘤中的清除速率，因此在注射后6小時達到腫瘤攝取量,，而在注射后12小時獲得TNR峰值(7.62±1.05,，圖4j)。根據(jù)勞斯判據(jù),，至少需要5的TNR才能區(qū)分圖像特征,。在近紅外二區(qū)成像中，PSMA-1092的TNR值在注射后8小時達到5.99±0.72,，并在隨后的時間點保持高水平(注射后12小時為7.62±1.05,，注射后24小時為6.66±1.48，圖4j),，TNR值始終高于勞斯判據(jù),，可實現(xiàn)高質(zhì)量的近紅外二區(qū)成像。為了驗證PSMA-1092對PSMA的特異性,，我們進一步對荷瘤小鼠進行了阻斷實驗(每組n=3),。聯(lián)合注射2-PMPA(一種強效和選擇性的谷氨酸羧肽酶II抑制劑，IC50=300 pM,，34.3 mg/kg體重)和PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)后于選定時間點獲得NIR-II圖像(792 nm激光激發(fā),，1000 nm LP濾光片，50 ms曝光時間),。只注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)的荷瘤小鼠作為對照,，如圖4k所示,，在阻斷組中，活體小鼠的大部分腫瘤信號可被2-PMPA抑制,，半定量分析表明，注射后6 h,，對照組的TNR值遠高于阻斷組(圖4m),，進一步的離體成像顯示，聯(lián)合注射2-PMPA和PSMA1092后,，來自腫瘤和腎臟的熒光信號被成功降低(圖4l),。這些結果很好地證明了PSMA-1092是PSMA的特異性配體，具有超高的親和力,，滿足了NIR-II探針的成像需求,。

為了驗證PSMA-1092在腫瘤切除手術中進行精確熒光圖像導航的可行性,，作者選擇活體LNCaP（人前列腺癌細胞）荷瘤小鼠在麻醉下進行腫瘤切除試驗。根據(jù)上述影像數(shù)據(jù),，選擇在尾靜脈注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重) 24 h后作為手術的時間窗,，以獲得背景信號。在整個手術過程中,，小鼠以0.4 L/ min的速度被異氟醚和氧氣聯(lián)合氣體麻醉,，在NIR-II近紅外二區(qū)導航下切除腫瘤，整個過程由顯像儀記錄,。首先,，解剖腫瘤區(qū)域周圍皮膚，暴露腫瘤(圖5b,c),。半定量分析顯示,，切除覆蓋皮膚后，TNR值增加(從7.95增加到9.81,，圖5n),。然后切除腫瘤(圖5d,f,g)，肉眼檢查認為腫瘤已*切除,。但周邊仍可見強烈的熒光信號(圖5i),， TNR值為5.48(圖5n),，提示手術邊緣仍有遺漏的殘余腫瘤。在NIR-II熒光成像引導下,，進一步切除殘余腫瘤(圖5j),，同時盡可能保持健康組織，切除后TNR值降至3.12(圖5n),。但擴大切除后,，剩余組織中仍能檢測到熒光信號(圖5j)。進一步檢查發(fā)現(xiàn)漏診的微小腫瘤(圖5k,l,，紅色箭頭所示),，再進一步切除腫瘤，影像學檢查未見殘留熒光信號(TNR = 2.97,，圖5m,n),。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織學研究表明，切除的腫瘤是低分化癌,?？偟膩碚f，PSMA-1092探針具有出色的腫瘤描繪能力,，在腫瘤切除術中導航方面具有臨床轉化潛力,。

參考文獻

Zhang Longfei et al. Visualizing Tumors in Real Time: A Highly Sensitive PSMA Probe for NIR-II Imaging and Intraoperative Tumor Resection.[J]. Journal of medicinal chemistry, 2021

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