本文要點(diǎn)：前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤細(xì)胞膜上過(guò)表達(dá)的一種II型跨膜糖蛋白，PSMA的表達(dá)水平與前列腺癌分期和Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，因此,，PSMA可作為一種評(píng)估PCa（前列腺癌）的有效生物標(biāo)志物。

現(xiàn)如今盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種治療前列腺癌的藥物,，前列腺切除術(shù)仍然是不錯(cuò)的治療方法和早期患者可選擇的辦法,，但是前列腺癌(PCa)由于其復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，在保留癌旁組織的同時(shí)對(duì)腫瘤進(jìn)行精確切除是一個(gè)挑戰(zhàn),。前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤細(xì)胞膜上過(guò)表達(dá)的一種II型跨膜糖蛋白,，PSMA的表達(dá)水平與前列腺癌分期和Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，因此,，PSMA可作為一種評(píng)估PCa（前列腺癌）的有效生物標(biāo)志物,。近年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一些針對(duì)前列腺特異性膜抗原（PSMA）進(jìn)行光學(xué)成像的探針，如CY7-3,、CY7-2和L16(圖1a),，它們?cè)诹姿猁}緩沖液(PBS)中的發(fā)射波長(zhǎng)分別為767、767和800 nm,，這些探針存在著近紅外一區(qū)（NIR-I）探針固有的缺點(diǎn),，例如穿透組織能力差，分辨率有限,。近紅外二區(qū) (NIR-II,，1000-1700 nm)成像自體熒光水平較低，光子散射小,，穿透能力強(qiáng),、具有高時(shí)空分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，可以顯著提高成像質(zhì)量,，可用于腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航,。

作者在本文中設(shè)計(jì)、合成了一種帶有兩個(gè)前列腺特異性膜抗原(PSMA)結(jié)合基元的探針(PSMA-1092),，該探針具有優(yōu)異的光學(xué)性能(λmax= 1092 nm),，對(duì)PSMA具有超高親和力(Ki= 80 pM)。采用PSMA-1092探針進(jìn)行小鼠NIR-II成像,，可以高分辨率顯現(xiàn)腫瘤(TNR= 7.62±1.05),，邊緣清晰，然后,，作者將PSMA-1092用于小鼠前列腺腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航,，在腫瘤切除過(guò)程中,，NIR-II成像可對(duì)肉眼檢查遺漏的殘余腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)成像檢測(cè)?？偟膩?lái)說(shuō),，PSMA-1092在描繪腫瘤邊緣和檢測(cè)殘余腫瘤方面表現(xiàn)良好，在臨床實(shí)踐中顯示了精確切除PCa腫瘤的潛力,。

圖1：(a)以前報(bào)告的PSMA熒光探針的結(jié)構(gòu),。藍(lán)色表示結(jié)合基序，紫色表示NIR-I區(qū)的熒光團(tuán),。(b)新設(shè)計(jì)的NIR-II PSMA探針的結(jié)構(gòu),。

考慮到供體-受體-供體(D−A−D)核心結(jié)構(gòu)以及合適的電子受體和電子供體部分是獲得NIR-II近紅外二區(qū)熒光探針的關(guān)鍵因素，作者選擇苯二聯(lián)體(1,2,5-噻二唑)部分作為優(yōu)良的電子受體,。以兩個(gè)((S)5-氨基-1-羧基)氨基甲酰)- l -谷氨酸(Glu-urea-Lys)作為與PSMA特異性結(jié)合的基團(tuán),，通過(guò)酰胺鍵與熒光團(tuán)部分結(jié)合，增強(qiáng)了探針與PSMA的親和力(圖1b),，此外,，Glu-urea-Lys基團(tuán)上的三個(gè)羧基也使探針具有較強(qiáng)的親水性，顯著提高了探針在水溶液中的溶解度,，PSMA-1092探針的合成路線如下（方案1）,。

方案1：試劑和條件:(a)丙烯酸、乙酸(20% in H2O),，100℃,，隔夜，94.5%; (b)叔丁醇,、DCC,、DMAP、CH2Cl2,，室溫,，隔夜，43.2%;(c)六丁基二錫烷, Pd(PPh3)4,，甲苯,，N2, 120℃, 2 h;(d) 4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑，PdCl2(PPh3)2,，甲苯,，N2, 120℃,2 h, 7.7%;（e）鐵粉，醋酸,，100℃，30分鐘,，36.2%;(f) PhNSO, TMSCl,，干吡啶,，80°C，過(guò)夜,，27.2%;(g) TFA, CH2Cl2,，室溫，4 h;(h) 2,3,5,6-四氟苯酚,，DCC, CH2Cl2,，室溫，5 h, 67.4%;(i)二叔丁基(((S)-6-氨基-1-(叔丁基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酰)- l –谷氨酸,，Et3N, CH2Cl2,，室溫，6 h, 61.3%,。

PSMA-1092探針由于D-A-D結(jié)構(gòu)中強(qiáng)烈的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng),，其熒光發(fā)射峰在1092 nm處測(cè)得(DMSO，圖2a,，b),，該峰位于近紅外二區(qū)，為了驗(yàn)證PSMA-1092的光穩(wěn)定性,，將其二甲基亞砜溶液暴露于激光(727nm,，10W)進(jìn)行30分鐘的連續(xù)輻射，沒(méi)有觀察到明顯的光降解(圖2c),，表明其出色的光穩(wěn)定性,。在PBS中測(cè)得PSMA-1092的量子產(chǎn)率為6.66%，這對(duì)于近紅外二區(qū)成像來(lái)說(shuō)是足夠高的,。利用近紅外成像系統(tǒng),，在不同的濾光片下進(jìn)一步比較了PSMA-1092在PBS中的近紅外熒光信號(hào)。PSMA-1092溶液在1000和1200nm LP濾光片下可見(jiàn),，而在1300或1400納米濾光片下未檢測(cè)到信號(hào)(圖2d),。考慮到在1000nmLP濾光片下的熒光信號(hào)比其他濾光片更強(qiáng),，選擇1000nmLP濾光片用于進(jìn)一步的體內(nèi)近紅外二區(qū)成像,。總的來(lái)說(shuō),，該探針具有良好的熒光發(fā)射波長(zhǎng),、較大的Stokes位移和優(yōu)異的光穩(wěn)定性，在體內(nèi)NIR-II近紅外二區(qū)成像方面具有很大的潛力,。

圖2：(a) PSMA-1092的光學(xué)特性,。在DMSO中吸收(λex1)和發(fā)射(λem1)波長(zhǎng)。PBS中測(cè)量的量子產(chǎn)量,。在酸性水溶液(pH = 2.66)中測(cè)定吸收光譜(λex2)和發(fā)射光譜(λem2),。Ki（受體親和力指數(shù)）通過(guò)LNCaP細(xì)胞（人前列腺癌細(xì)胞）裂解液的抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定,。Pka（結(jié)合常數(shù)）是根據(jù)Boltzmann曲線計(jì)算的。(b) PSMA-1092 (10 μM)在DMSO中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜,。(c) PSMA-1092 (10 μM)在727 nm連續(xù)激光照射DMSO中的光穩(wěn)定性,。(d) PSMA-1092 (0.43 mM)在PBS中與各種LP濾光片的NIR-II成像。白色虛線勾畫(huà)出了不可見(jiàn)的溶液,。

此外,，作者觀察到PSMA-1092的熒光性質(zhì)在不同pH值的溶液中發(fā)生了顯著變化(圖3a,b)，肉眼可以觀察到PSMA-1092溶液暴露在酸性溶液中,，在自然光下由青色變?yōu)榱练凵?圖3c),，在365 nm紫外光下(圖3d)或在NIR-I成像中(圖3e)可以觀察到熒光逐漸增加。熒光光譜顯示,，熒光極大值從1092 nm藍(lán)移至620 nm,且隨著溶液酸度的增加,，620nm處的熒光強(qiáng)度隨著溶液酸度的增加而大大提高(圖3a,b)，當(dāng)溶液pH從7變到0.3時(shí),，PSMA-1092溶液的熒光強(qiáng)度增加了85倍,。此外，PSMA-1092在620 nm處的熒光強(qiáng)度圖與pH值的Boltzmann曲線擬合良好(R2= 0.9984),，計(jì)算得到pKa為1.95(圖3b),。PSMA-1092的pH響應(yīng)突出了其在更廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，比如在非侵入性測(cè)量胃液pH值時(shí),，從NIR-II區(qū)域到NIR-I區(qū)域的巨大波長(zhǎng)位移可以有效地避免原始波長(zhǎng)的影響,，從而提高了檢測(cè)精度，進(jìn)一步的pH響應(yīng)應(yīng)用作者仍在研究當(dāng)中,。

為了進(jìn)一步測(cè)試PSMA-1092的體內(nèi)性能,，我們使用皮下LNCaP（人前列腺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠(n = 3)進(jìn)行NIR-II成像。尾靜脈注射PSMA-1092（劑量為2.5毫克/千克體重）,，在不同的時(shí)間點(diǎn)(1,、2、4、6,、8,、12、24 h,圖4) （792nm激光激發(fā),，100 mW / cm2 功率密度 ）(1000 nmLP濾光片,50 ms曝光時(shí)間)進(jìn)行NIR-II成像。如圖4所示,，PSMA -1092在注射后2小時(shí)內(nèi)在腫瘤及周圍組織中積累(圖4c),。注射后4小時(shí)，腫瘤與周圍組織區(qū)別開(kāi)來(lái),，具有良好的對(duì)比度(圖4d),，并且在隨后的時(shí)間點(diǎn)保持了高質(zhì)量圖像 (圖4e-h)，這表明成像性能優(yōu)異且在小鼠模型中具有高穩(wěn)定性,。為了獲得更詳細(xì)的藥代動(dòng)力學(xué)信息,，進(jìn)行了基于近紅外圖像的腫瘤與正常組織比率(TNR)的半定量分析。由于PSMA-1092在正常組織中的清除速率快于在腫瘤中的清除速率,，因此在注射后6小時(shí)達(dá)到腫瘤攝取量,，而在注射后12小時(shí)獲得TNR峰值(7.62±1.05，圖4j),。根據(jù)勞斯判據(jù),，至少需要5的TNR才能區(qū)分圖像特征。在近紅外二區(qū)成像中,，PSMA-1092的TNR值在注射后8小時(shí)達(dá)到5.99±0.72,，并在隨后的時(shí)間點(diǎn)保持高水平(注射后12小時(shí)為7.62±1.05，注射后24小時(shí)為6.66±1.48,，圖4j),，TNR值始終高于勞斯判據(jù)，可實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的近紅外二區(qū)成像,。為了驗(yàn)證PSMA-1092對(duì)PSMA的特異性,，我們進(jìn)一步對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行了阻斷實(shí)驗(yàn)(每組n=3)。聯(lián)合注射2-PMPA(一種強(qiáng)效和選擇性的谷氨酸羧肽酶II抑制劑,，IC50=300 pM,，34.3 mg/kg體重)和PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)后于選定時(shí)間點(diǎn)獲得NIR-II圖像(792 nm激光激發(fā)，1000 nm LP濾光片,，50 ms曝光時(shí)間),。只注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)的荷瘤小鼠作為對(duì)照，如圖4k所示,，在阻斷組中,，活體小鼠的大部分腫瘤信號(hào)可被2-PMPA抑制，半定量分析表明，注射后6 h,，對(duì)照組的TNR值遠(yuǎn)高于阻斷組(圖4m),，進(jìn)一步的離體成像顯示，聯(lián)合注射2-PMPA和PSMA1092后,，來(lái)自腫瘤和腎臟的熒光信號(hào)被成功降低(圖4l),。這些結(jié)果很好地證明了PSMA-1092是PSMA的特異性配體，具有超高的親和力,，滿足了NIR-II探針的成像需求,。

為了驗(yàn)證PSMA-1092在腫瘤切除手術(shù)中進(jìn)行精確熒光圖像導(dǎo)航的可行性,，作者選擇活體LNCaP（人前列腺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠在麻醉下進(jìn)行腫瘤切除試驗(yàn)。根據(jù)上述影像數(shù)據(jù),，選擇在尾靜脈注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重) 24 h后作為手術(shù)的時(shí)間窗,，以獲得背景信號(hào)。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中,，小鼠以0.4 L/ min的速度被異氟醚和氧氣聯(lián)合氣體麻醉,，在NIR-II近紅外二區(qū)導(dǎo)航下切除腫瘤，整個(gè)過(guò)程由顯像儀記錄,。首先,，解剖腫瘤區(qū)域周圍皮膚，暴露腫瘤(圖5b,c),。半定量分析顯示,，切除覆蓋皮膚后，TNR值增加(從7.95增加到9.81,，圖5n),。然后切除腫瘤(圖5d,f,g)，肉眼檢查認(rèn)為腫瘤已*切除,。但周邊仍可見(jiàn)強(qiáng)烈的熒光信號(hào)(圖5i),， TNR值為5.48(圖5n)，提示手術(shù)邊緣仍有遺漏的殘余腫瘤,。在NIR-II熒光成像引導(dǎo)下,，進(jìn)一步切除殘余腫瘤(圖5j),，同時(shí)盡可能保持健康組織，切除后TNR值降至3.12(圖5n),。但擴(kuò)大切除后,，剩余組織中仍能檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖5j)。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)漏診的微小腫瘤(圖5k,l,，紅色箭頭所示),，再進(jìn)一步切除腫瘤，影像學(xué)檢查未見(jiàn)殘留熒光信號(hào)(TNR = 2.97,，圖5m,n),。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織學(xué)研究表明，切除的腫瘤是低分化癌,。總的來(lái)說(shuō),，PSMA-1092探針具有出色的腫瘤描繪能力,，在腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航方面具有臨床轉(zhuǎn)化潛力。

參考文獻(xiàn)

Zhang Longfei et al. Visualizing Tumors in Real Time: A Highly Sensitive PSMA Probe for NIR-II Imaging and Intraoperative Tumor Resection.[J]. Journal of medicinal chemistry, 2021

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