α-淀粉酶活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1012

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡介：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶,。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解,，生成葡萄糖,、麥芽糖,、麥芽三糖,、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低,，因此又稱為液化酶,。淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì),，在540nm有吸收峰,；通過測定540nm吸光度增加速率，計算淀粉酶活性,。α-AL耐熱,，但是β-淀粉酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過70℃鈍化15min,，就只有α-AL能夠催化淀粉水解,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進行檢測,。  

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：若有黃色晶體析出,，需加熱溶解后再用；

2. 試劑二：臨用前加入10mL蒸餾水,，置于常溫水中并加熱至煮沸,，期間不斷攪拌粉劑至溶解；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg無水葡萄糖,。臨用前加1mL蒸餾水,，配成10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀或可見分光光度計,、恒溫水浴鍋,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、96孔板/微量玻璃比色皿,、研缽/勻漿器和蒸餾水。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻） 

稱取約0.1g樣本，加0.8mL蒸餾水勻漿,；勻漿后在室溫下放置提取15min,，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；6000g，室溫離心10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10mL,，搖勻,，即為淀粉酶原液。

二,、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長到540nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5,、0.4、0.3,、0.2,、0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 取250μL樣本沸水浴5min作為對照管使用,。

4. 按照操作表依次加入各個試劑：

混勻，沸水浴10min,，取200μL至96孔板或微量比色皿中,，540nm處讀取對照管、測定管,、標(biāo)準(zhǔn)管,、空白管的吸光度，分別記為A對照,、A測定,、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白，計算ΔA測定=A測定-A對照,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白,。

三、α-淀粉酶活性計算 

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：  

以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸,，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到方程y=kx+b,。將ΔA測定帶入方程得到x （mg/mL）。

2,、 α-淀粉酶活性的計算：

（1）按照樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個酶活力單位,。

α-淀粉酶活性(U/g質(zhì)量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2×x÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1m 還原糖定義為1個酶活性單位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.075mL,；V樣總：提取液總體積,，10mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時間,，5min,。

注意事項：

測定的吸光值大于1.5時,，可以對樣本進行適當(dāng)稀釋后測定。若吸光值過小,，可以濃縮淀粉酶稀釋液或者淀粉酶原液,。