α-淀粉酶活性檢測(cè)試劑盒（可見(jiàn)分光光度法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1011

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

淀粉水解酶,，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶,。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機(jī)催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖,、麥芽糖,、麥芽三糖、糊精等還原糖,，同時(shí)使淀粉的粘度降低,，因此又稱(chēng)為液化酶。淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖,，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì),，在540nm有吸收峰；通過(guò)測(cè)定540nm吸光度增加速率,，計(jì)算淀粉酶活性,。α-AL耐熱,，但是β-淀粉酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過(guò)70℃鈍化15min,，就只有α-AL能夠催化淀粉水解,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。  

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：若有黃色晶體析出,，需加熱溶解后再用；

2. 試劑二：臨用前加入20mL蒸餾水,，置于常溫水中并加熱至煮沸,，期間不斷攪拌粉劑至溶解；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg無(wú)水葡萄糖,。臨用前加1mL蒸餾水,，配成10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀或可見(jiàn)分光光度計(jì),、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)） 

稱(chēng)取約0.1g樣本,，加0.8mL蒸餾水勻漿,；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次,，使其充分提?。?/span>6000g,，室溫離心10min,，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10mL，搖勻,，即為淀粉酶原液,。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.3,、0.25,、0.2,、0.15、0.1,、0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

3. 取250μL樣本沸水浴5min作為對(duì)照管使用。

4. 按照操作表依次加入各個(gè)試劑：

混勻,，沸水浴10min，540nm處讀取對(duì)照管,、測(cè)定管,、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管吸光度,，分別記為A對(duì)照,、A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白,，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。

三,、α-淀粉酶活性計(jì)算 

1,、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：  

以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到方程y=kx+b。將ΔA測(cè)定帶入方程得到x （mg/mL）,。

2,、 α-淀粉酶活性的計(jì)算：

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α-淀粉酶活性(U/g質(zhì)量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2×x÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1m 還原糖定義為1個(gè)酶活性單位,。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x÷Cpr

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.25mL；V樣總：提取液總體積,，10mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，5min,。

注意事項(xiàng)：

測(cè)定的吸光值大于1時(shí)，可以對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定,。若吸光值過(guò)小,，可以濃縮淀粉酶稀釋液或者淀粉酶原液,。