G6P檢測試劑盒（WST-8法）

產(chǎn)品貨號：BA18003

產(chǎn)品規(guī)格：100次

產(chǎn)品簡介：

尚寶的G6P檢測試劑盒(WST-8法) (G6P Assay Kit with WST-8)是一種高靈敏度的基于WST-8的顯色反應(yīng),，通過比色法來檢測細(xì)胞,、組織或其它樣品中G6P含量的檢測試劑盒,。 ?

WST-8是MTT的一種升級替代產(chǎn)品,，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT,、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先,，MTT被一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的,，需要有特定的溶解液來溶解；而WST-8和XTT,、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,，可以省去后續(xù)的溶解步驟,。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解,。再次,，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定,。另外,，WST-8和MTT、XTT等相比,，線性范圍更寬,，靈敏度更高。WST-8和WST-1相比,，檢測靈敏度更高,，更易溶解，并且更加穩(wěn)定,。 ?

本試劑盒使用便捷,。使用細(xì)胞、組織等的裂解液即可進(jìn)行檢測,，無需分離純化細(xì)胞,、組織或其它樣品中的G6P。 ? 本試劑盒檢測靈敏度高,，線性范圍寬,。可以檢測含量低至20μM (1nmol)的G6P,，在20μM (1nmol)至500μM (25nmol)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,。 ?

G6P (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸,，又稱6-磷酸葡萄糖)是葡萄糖的第6位碳上的羥基在己糖激酶催化下發(fā)生磷酸化后生成的分子,，是細(xì)胞中常見的糖代謝小分子，參與糖酵解(glycolytic pathway)和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway)等生化途徑,。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸,，然后通過磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸,，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中,，葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物,，該過程也是生成NADPH的主要途徑。除了這兩個(gè)代謝途徑外,，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被存儲(chǔ)起來,。 ?

本試劑盒可檢測樣品中的G6P含量,，具體原理如下：葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，在這一反應(yīng)中NADP+ 被還原為NADPH,，生成的NADPH在電子耦合試劑1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下將WST-8還生成橙黃色的formazan,，在450nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中總的G6P的量呈正比關(guān)系,。 WST-8法檢測G6P的原理參考圖1,。

本試劑盒適用于檢測細(xì)胞、組織以及其它適當(dāng)樣品中G6P的含量,。 ?

本試劑盒可以測定100個(gè)樣品,。

產(chǎn)品組成：

使用說明：

1. 樣品的準(zhǔn)備：

a. G6P提取液室溫或37oC水浴解凍，解凍后置于冰浴,。如果37℃水浴解凍,，須注意解凍后立即置于冰浴。

b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：對于貼壁細(xì)胞,，約1×10⁶個(gè)細(xì)胞(大約相當(dāng)于6孔板一個(gè)孔長滿的細(xì)胞數(shù)量),，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液,，并輕輕吹打,，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；對于懸浮細(xì)胞,，收集約1×10⁶個(gè)細(xì)胞,，600g離心5分鐘，吸凈培養(yǎng)液,，用移液器加入200μl冰浴預(yù)冷的G6P提取液,，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解,。裂解過程宜盡量在冰上操作,。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘,，取上清作為待測樣品,，冰浴存放備用。

c. 組織樣品的準(zhǔn)備：冰浴預(yù)冷的PBS洗滌組織后,，稱取約10-50mg的組織樣品,，用剪刀剪碎，置于勻漿器中,，加入400μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液在冰上或室溫進(jìn)行勻漿,。隨后12,000g，4oC離心5-10分鐘,，取上清作為待測樣品,，冰浴存放備用,。注：勻漿過程在冰上或室溫操作均可，但以冰浴操作為佳,，可以有效減少內(nèi)源性G6P水平的下降,。

d. 液體樣品可以直接進(jìn)行檢測。

注意：如果樣品中存在能轉(zhuǎn)變或消耗G6P的酶,，在檢測前需使用10kDa超濾管去掉蛋白質(zhì)以避免酶的影響,。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：

a. G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：把10mM的G6P標(biāo)準(zhǔn)品用G6P提取液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取Ｈ绯醮螜z測可以設(shè)置0,、31.25,、62.5、125,、250,、500μM這幾個(gè)濃度，檢測時(shí)96孔板每孔加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品,，相當(dāng)于每孔加入的G6P的量為0,、1.56、3.125,、6.25,、12.5、25nmol,。如有必要,，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)樣品中的G6P含量對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0μM的點(diǎn)為空白對照點(diǎn)(Blank),，僅含G6P提取液,。

b. G6P檢測液的配制：樣品中的NADPH等可能會(huì)產(chǎn)生一定的背景，建議設(shè)置加入樣品而不加入酶混合液的背景對照,；對于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的G6P檢測液,，需要加入酶混合液。每個(gè)背景對照,、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的檢測需要使用50μl的G6P檢測液,，請根據(jù)所需檢測的背景對照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量,，配制適量的G6P檢測液,，并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。G6P檢測液的配制方法如下：

3. 樣品測定：

a. 樣品中G6P含量的測定：吸取50μl待測樣品至96孔板中,，為了減少實(shí)驗(yàn)建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的G6P含量過高,，超出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍,，則需要用G6P提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測,；含量過低時(shí)則需要 加大細(xì)胞或組織樣品的用量。

b. 每孔加入50μl G6P檢測液,，用移液槍輕輕吹打均勻,。在加入G6P檢測液的過程中須輕柔操作，以免產(chǎn)生氣泡,。若不慎出現(xiàn)氣泡,，可使用細(xì)小的吸頭或針頭戳破。背景對照孔需要加入50μl不含G6P底物的G6P檢測工作液,。特別注意：如果樣品中的NADPH等產(chǎn)生的背景比較高,，就必須設(shè)置背景對照；初次檢測宜設(shè)置背景對照,。

c. 37℃避光孵育10分鐘,，此時(shí)會(huì)形成橙黃色的formazan。測量450nm處的吸光度,，如果顯色較淺,，也可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間至15-30分鐘，隨著孵育時(shí)間的延長顯色會(huì)越來越深,。

4. 樣品中G6P含量的計(jì)算：

a. 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0μM的空白對照(Blank)吸光度,。同時(shí)，如果背景對照(Background)的吸光度比較高,，需要再將所有樣品的吸光度減去各自的背景對照的吸光度,。

b. 以G6P濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。G6P標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果請參考圖2。

圖2. 本試劑盒檢測G6P的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。圖中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘,。不同的檢測條件下，實(shí)際讀數(shù)會(huì)因標(biāo)準(zhǔn)品的配制,、檢測儀器等的不同而存在差異,，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

c. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞,、組織等樣品中的G6P濃度,。

備注：根據(jù)檢測得到的濃度及樣品的體積，即可計(jì)算出G6P的量,。

d. 如果希望更加精確地來表述G6P的量,，可以將樣品用BCA法測定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中G6P的量來比較精確地進(jìn)行表述。

注意事項(xiàng)：

1. 經(jīng)檢測本試劑盒中的酶混合液室溫存放72小時(shí)或反復(fù)凍融5次不影響其酶活性,。 ?

2. 由于G6P提取液略顯粘稠,，以該提取液作為稀釋液時(shí)，無論對標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品進(jìn)行稀釋,，在稀釋過程中務(wù)必確保稀釋均勻,，否則易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大波動(dòng)。 ?

3. 在樣品加樣和混勻過程中,，須盡量避免產(chǎn)生氣泡,，以免影響最終的吸光度測定。 ?

4. 如果不能非常嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間,，每次檢測都需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線,。 ?

5. 如果樣品溶液中G6P濃度過高或過低，不在試劑盒的線性檢測范圍內(nèi)時(shí),，可適當(dāng)調(diào)整樣品或者提取液的用量,。 ?

6. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測，凍存或反復(fù)凍融的細(xì)胞或組織樣品可能對結(jié)果有一定影響,。 ?

7. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,，不得存放于普通住宅內(nèi),。

8. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

保存條件：-20oC保存,，一年有效。顯色液須-20oC避光保存,。