石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1793

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

從固定在福爾馬林中提取和純化出來(lái)的蛋白,，可用于western blot,，RPA，質(zhì)譜,，2D電泳分析,。

產(chǎn)品組成： 

試劑盒成分保存

提取緩沖液EXB應(yīng)存放在-20°C。FFPE試劑盒中其它的組分應(yīng)存放在室溫干燥環(huán)境(15-25°C),。FFPE中的其它成分正庚烷,甲醇,，氯仿應(yīng)儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)藏柜中，此條件下,，該試劑盒至少可以穩(wěn)定保存12個(gè)月,。

載玻片上的石蠟組織切片脫蠟:

用戶須自備的設(shè)備和試劑：

100%，96%,，和70%(V/V)乙醇

石蠟包埋切片脫蠟罐

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前注意事項(xiàng):

二甲苯清洗(步驟1和2)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將載玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的裝有二甲苯的容器中，玻片要被二甲苯*覆蓋,，室溫(15-25°)孵育10min,。

2. 重復(fù)步驟1兩次，每次使用新的二甲苯,。

3. 將玻片放入100%乙醇中室溫孵育10min,，使用新的100%乙醇重復(fù)此步。

4. 將玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有96%的乙醇的容器中孵育10min,，使用新的96%乙醇重復(fù)這一步驟,。

5. 將玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有70%的乙醇的容器中孵育10min，使用新的70%乙醇重復(fù)這一步驟,。

6. 浸在雙蒸餾水中30s,，用紙巾小心地擦去玻片上的水。

注意：紙巾不要觸碰到組織,，確保組織不要干。

7. 用針劃要的組織轉(zhuǎn)移到離心管中,。

8. 從FFPE組織切片中提取的總蛋白可進(jìn)行western blot,。

直接從一塊石蠟包理樣本中脫蠟:

用戶須自備的設(shè)備和試劑：

微型離心機(jī)(適合于1.5ml離心管)

渦旋混合器

100%，96%,，and70%(vv)乙醇

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前注意事項(xiàng)：

所有離心步驟都是在20-25°C使用臺(tái)式進(jìn)行離心(例如,，Eppendorf® Micro Centrifuge 5417C or HeraeusBiofuge® 15 ),。

二甲苯洗滌應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)步驟:

1. 從同一塊組織中切3片10-15m厚切片,。

2. 立即把切片放在1.5毫升離心管中(提供),。

3. 向管子中加入1ml二甲苯，用力渦旋10s,，孵育10min,。

4. 將管子放入微型離心機(jī)中全速離心2min，小心棄掉上清,。

5. 重復(fù)步驟3,，4兩次。

6. 加入1ml無(wú)水乙醇到包含有顆粒的管子中,，渦旋混勻,。孵育10min，全速離心2min,。

7. 小心棄掉上清,。

8. 不要攪亂管底顆粒

9. 重復(fù)步驟6。

10. 加1mL96%乙醇到管中,，渦旋混勻,。孵育10分鐘，全速離心2min,。

11. 小心棄掉上清,。

12. 不要攪亂管底顆粒。

13. 重復(fù)步驟11,，12,。

14. 加1mL70%乙醇到管中，渦旋混勻,。孵育10分鐘,，全速離心2min。

15. 小心棄掉上清,。

16. 不要攪亂管底顆粒,。

17. 重復(fù)步驟14，15,。

注意：如有必要,，重復(fù)離心的步驟，盡量去除乙醇?xì)埩?。不要攪亂和棄掉管底顆粒,。

18. 從FFPE組織切片中提取的總蛋白可進(jìn)行進(jìn)行westem blot。

從石蠟組織切片中提取的總蛋白用于western blot實(shí)驗(yàn):

用戶須自備的設(shè)備和試劑:

一次性手套

臺(tái)式離心機(jī)或微型離心機(jī)（轉(zhuǎn)速能達(dá)到14000xg）

渦旋混勻器

水浴或者金屬浴鍋（溫度能夠達(dá)到100℃）

熱電攪拌器(Eppendorf,德國(guó))

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前注意事項(xiàng)

使用β-巰基乙醇應(yīng)在通風(fēng)櫥中操作

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前注意事項(xiàng):

提供的提取緩沖液EXB未加β-巰基乙醇,，每次提取過(guò)程中添加6μLβ-巰基乙醇到提取94μL的提取緩沖液EXB獲得工作液,。

蛋白提?。?/span>

1. 取100μL提取緩沖液EXB(已加入β-巰基乙醇)加入到裝有組織的1.5ml的離心管中，渦旋混勻,，用密封夾封號(hào)離心管,。

2. 冰上孵育5min，渦旋混勻,。

注意:確定離心管已經(jīng)被密封好后在進(jìn)行步驟3,。

3. 將離心管放在水溶鍋中100°C孵育20min。

4. 使用熱電攪拌器,，以750rpm速度,，80℃，攪拌2h,。

5. 然后將離心管放在4℃,，1min，去掉密封夾,。

6. 將離心管置于離心機(jī)中,，4℃，14000xg,，離心15min,。

7. 轉(zhuǎn)移含所提蛋白質(zhì)的上清液到一個(gè)新的1.5毫升的離心管中(提供)。

從FFPE組織中提取蛋白—用于雙向電或MS分析:

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前注意事項(xiàng):

提供的提取緩沖液EXB未加β-巰基乙醇,。每次提取過(guò)程中添加6μLβ-巰基乙醇到提取94μL的提取緩沖液EXB獲得工作液,。

流程:

脫蠟:

1. 從同一塊組織中切3塊10-15μm厚切片。

注意：如果你不確定你的樣品中含有多少蛋白質(zhì),，我們建議使用2個(gè)切片,，每一個(gè)厚度為10um，面積100平方毫米制備,。

2. 把切片在1.5毫升離心管中(提供),。

3. 吸取0.5mL的庚烷到管子中，蓋緊管子用力渦旋10s,，室溫孵育1h(15-25℃),。

4. 加25μL甲醇，扣緊管子,，大力渦旋10s,。

5. 9000xg離心2分鐘。

管底會(huì)出現(xiàn)沉淀

6. 小心棄掉上清,，在空氣中干燥5min,。

蛋白提取

7. 取100μL提取緩沖液EXB(已加入β-巰基乙醇)加入到裝有組織的1.5mL的離心管中，渦旋混勻，用密封夾封號(hào)離心管,。

8. 冰浴5min，然后渦旋混勻,。

確保離心管密封好再進(jìn)行步驟9,。

9. 將離心管在100℃水浴鍋中孵育20min。

10. 使用熱電攪拌器,，以750rpm速度,，80℃，攪拌2h,。

11. 然后將離心管放在4℃,，1min，去掉密封夾,。

在進(jìn)行12步之前確定密封夾已經(jīng)被去除,。

12. 將離心管置于離心機(jī)中，4℃,，14000xg,，離心15min。轉(zhuǎn)移含所提蛋白質(zhì)的上清液到一個(gè)新的1.5mL的離心管中(提供),。

雙向電泳蛋白樣品制備:

13. 加400μL甲醇到100μL步驟12所得的蛋白溶液中,，扣緊蓋子，大力渦旋10s,。

14. 9000xg離心10s,。

15. 加100μL氯仿，扣緊管子,，大力渦旋10s,。

16. 9000xg離心10s。

17. 加300μL水,，扣緊管子,，用力渦旋10s。

18. 9000xg離心1min,。

注意：離心后,，樣品分為3層：最層，無(wú)色,，有機(jī)相(氯仿),；中間層含蛋白質(zhì)；上部,，無(wú)色,，水相。

19. 小心棄掉上層水相,。

不要攪亂中間層和底層,。

20. 加300μL甲醇,，扣緊蓋子，大力渦旋,。

21. 9000xg離心2min,。

22. 小心棄掉上清。

注意:該蛋白是位于管子底部的可見(jiàn)的透明或白色凝膠狀沉淀,。

23. 加入1mL乙醇到離心管中洗滌沉淀,，而后9000xg離心2min，小心棄掉上清,。

注意:不要使沉淀干燥

24. 加入適量體積的緩沖液溶解蛋白沉淀用于雙向電泳,。

根據(jù)凝膠尺寸和染色方法，雙向電泳分析所需的蛋白質(zhì)量從50-250μg,。