氨基比林-N-去甲基化酶（AND）活性檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

產(chǎn)品貨號：BA1046

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡介：

細胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中,，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系,。AND作為P450酶系的重要一員,，相當于CYP3A4亞型,，與藥物的去甲基化反應密切相關(guān),。

AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量,，即可計算出AND活性,。

產(chǎn)品組成：

試劑一：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解,。

試劑二：液體×1瓶,，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管,，4℃避光保存,。臨用前加入1mL無水乙醇，充分溶解,。

試劑四：粉×1管,，4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水,，充分溶解,。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存,。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解,。

試劑六：液體×1瓶，室溫保存,。

試劑七：液×1瓶,，4℃保存。

標準液：液體×1瓶,，-20℃保存,。臨用前取1.5mLEP管，加入10µl標準液,，加990µl蒸餾水,，混勻即為0.05mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存,。

需自備的儀器和用品： 

普通離心機,，超速離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍,、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板,、蒸餾水,、無水乙醇和冰。

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/span> 

1. 除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一,，冰上充分研磨,，10000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管,。

2. 粗制微粒體：4℃,，100000g，離心60min,，棄上清液,。

3. 除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解,，100000g離心30min,，棄上清液。

4. 最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,，蓋緊后充分震蕩溶解,，即粗酶液，待測,。該待測液需當天使用,。

二、AND活性測定步驟： 

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min,，調(diào)節(jié)波長到412nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min,。

3. 對照管：取1支EP管,，加入10µL粗酶液，170µL試劑二,，10µL試劑三,，10µL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min,；立即加入35µL試劑五,，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35µL試劑六,，混勻后室溫靜置5min,；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管,，加入100µL上清液,，100µL試劑七，混勻后60℃水浴10min,，然后取出,，用冷水冷卻5min,，于412nm測定光吸收，記為A對照管,。

4. 測定管：取1支EP管，加入10µL粗酶液,，170µL試劑二,，10µL試劑三，10µL試劑四,，混勻后置于37℃水浴保溫30min,；立即加入35µL試劑五，混勻后置于冰浴中5min,；取出后加入35µL試劑六,，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min,；取1支新EP管,，加入100µL上清液，100µL試劑七,，混勻后60℃水浴10min,，然后取出，用冷水冷卻5min,，于412nm測定光吸收,，記為A測定管。

5.  標準管：取1支EP管,，加入100µL標準品,，100µL試劑七，混勻后60℃水浴10min,，然后取出,，用冷水冷

卻5min，于412nm測定光吸收,，記為A標準管,。

注意：每個樣品都需要做對照管。

三,、AND活性計算： 

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

=45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

 =22.5×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W,。

C標準品：0.05 mmol/L=50µmol/L；

V標準品：100µL=0.0001 L,；

稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（10+170+10+10+35+35）÷100=2.7,；

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；

V樣：加入粗酶液體積,，10µL=0.01mL；

V樣總：提取液體積,，0.5mL,；

W：樣本質(zhì)量，g ,；

T：催化反應時間（min）,，30min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位,。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

=45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷ Cpr,。

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(V樣÷V樣總×W)÷T =22.5×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷W,。

C標準品：0.05 mmol/L=50µmol/L,；

V標準品：100µL=0.0001 L；

稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7,；

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；

V樣：加入粗酶液體積,，10µL=0.01mL；

V樣總：提取液體積,，0.5mL,；

W：樣本質(zhì)量，g ,；

T：催化反應時間（min）,，30min。

注意事項：

1. 粗酶液需在當日完成測定,，如需保存,，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后,，-80℃保存,；

2. 試劑三和試劑四需臨用前配制，如當天沒有用完,，4℃避光保存,，可用1周；

3. 粗酶液可直接用于蛋白濃度測定,，建議用BCA法測蛋白含量,。