α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

產(chǎn)品貨號：BA1016

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：粉劑×1瓶,，-20℃保存；臨用前每瓶加入12mL雙蒸水,，充分溶解備用,；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體15mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支,，5μmol/mL的對硝基苯酚溶液,。

產(chǎn)品說明：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān),，而且與細(xì)胞識別和一些信號分子產(chǎn)生密切相關(guān),。

α-GC 分解對-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰,，通過測定吸光值升高速率來計算α-GC 活性,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照每1000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％,，超聲3秒,，間隔10秒，重復(fù)30次）,，15000g,，4℃，離心20min,，取上清,，置冰上待測。

2,、組織的處理：稱取約0.2g組織,，加入1mL提取液進行冰浴勻漿；15000g,，4℃,，離心20min，取上清,，置冰上待測,。

3,、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取100μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入到400μL 試劑三中,，得到1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,，十倍稀釋到100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋：50,、25,、12.5、6.25,、0 nmol/mL,。100、50,、25,、12.5、6.25,、0 nmol/mL做標(biāo)準(zhǔn)液,。

二、測定步驟和加樣表：

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至400nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表

充分混勻,，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min后,，立即放入沸水浴中煮沸5min（蓋緊,，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻,，8000g,，4℃，離心5min,，取上清液（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻,，室溫靜置2min后， 400nm處測定吸光值A,，計算ΔA=A測定管-A對照管,。

三、α-GC 活力計算：

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（x,，各標(biāo)準(zhǔn)管減去濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)管為標(biāo)準(zhǔn)管A）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2,、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA（x）帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

GC 活力(U/mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr

需要另外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

GC 活力(U/g鮮重) = (y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=18.67×y÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位,。

GC 活力(U/10⁴ cell)=(y×V反總)÷(1000×V樣÷V樣總)÷T=0.0187×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.28mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.03mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；W：樣品質(zhì)量,，g；1000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，1000萬,；T：反應(yīng)時間，0.5h,。