谷氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定,。

產品貨號：BA1121

產品規(guī)格：50管/48樣

產品簡介：

GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質體中,，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同構成GS/GOGAT循環(huán),，參與氨同化的調控。

GOGAT以NADH為電子供體,，催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸形成兩分子的谷氨酸,，NADH在340nm 吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

產品內容：

提取液：液體60mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑一：液體60mL×1瓶,，4℃保存； 

試劑二：粉劑×2支,，4℃保存,；

試劑三：粉劑×2支，4℃保存,；

試劑四：粉劑×2支,，-20℃保存。

工作液的配制：取試劑二,、試劑三,、試劑四各一支加入30mL試劑一中溶解。現用現配,?？煞盅b后-20℃保存，避免反復凍融,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調式移液器,、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復30次）；10000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測,。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿,。10000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

二,、測定步驟：

1,、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm,，光度計蒸餾水調零,。

2、 工作液提前配置,，平衡至室溫,。

3、 樣本測定：

三、GOGAT活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

GOGAT（U/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

GOGAT（U/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.643×ΔA

V反總：反應體系總體積,，10^-3L,；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.1mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數,，500萬,。

注意事項：

1、 測定期間樣本在冰上放置,，以免變性和失活,。

2、 最好兩個人同時做此實驗,，一個人比色,，一個人計時，以保證實驗結果的準確性,。

3,、 當A1大于1.5或者ΔA大于0.6時，建議將樣品用蒸餾水稀釋后測定,，當ΔA過小時,，可以延長酶促反應時間（10min或15min）或者加大加入的樣品體積進行測量。

4,、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL）,，所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量。