琥珀酸脫氫鈉（SDH）活性檢測(cè)試劑盒（可見(jiàn)分光光度法）

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1164

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品說(shuō)明：

SDH（EC1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶,，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一,。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子,。

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸,，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰,，通過(guò)600nm吸光度的變化,，測(cè)定2．6-DPIP的還原速度，代表SDH酶活性,。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體60mL×1瓶,，-20℃保存；

試劑二：液體0.6mL×1瓶,，-20℃保存,；

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存,；

試劑四：粉劑×1瓶,，4℃保存；臨用前加入到試劑三中溶解待用,；

試劑五：粉劑×1瓶,，4℃保存；臨用前加入4mL雙蒸水,，用不完的試劑仍4℃保存,；

試劑六：粉劑×1瓶，-20℃保存,；臨用前加入3.333mL雙蒸水,，用不完的試劑4℃保存。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì),、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、SDH的提取

準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞,，加入1mL試劑一和10uL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨,，4℃11000g離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

二,、測(cè)定步驟和加樣表

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、樣本測(cè)定

    依次加各試劑到1mL比色皿中，在加入試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),；在600nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1,，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)1分鐘,；迅速取出比

色皿并擦干,，600nm下比色，記錄1分20秒時(shí)的吸光度A2,，計(jì)算ΔA=A1-A2,，得到ΔA測(cè)定，ΔA空白,。

三,、SDH活性的計(jì)算

用1mL比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（U/mgprot）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T

＝1555.556×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

SDH活性（U/g鮮重）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T

＝1571.111×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位,。

SDH活性（U/10⁴cell）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T

＝3.142×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.98×10^-3L,；            ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù),，21×10³L/mol/cm；  

d：比色皿光徑,，1cm,；                       V樣：加入樣本體積，0.03mL,；

V樣總：加入試劑一和試劑二體積,，1.01mL,；      T：反應(yīng)時(shí)間，1min,；

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；                W：樣品質(zhì)量,，g,；

500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn),。

注意事項(xiàng)：

1,、測(cè)定過(guò)程中所有試劑和樣本在冰上放置,，以免變性失活,。

2,、若ΔA大于0.5,，需將酶液用酶提取液稀釋,，使ΔA小于0.5,，可提高檢測(cè)靈敏度,。