濾紙酶檢測(cè)試劑盒（微量法）

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1203

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

測(cè)定意義：

纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系,，能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活力對(duì)纖維素酶的研究具有非常重要的意義,。

測(cè)定原理：

濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物,，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比,，可測(cè)定計(jì)算得濾紙酶的活力,。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存,。

試劑二：液體40mL×1瓶,，4℃保存。

濾紙條：50mg×50條,。

需自備的儀器和用品：

天平,、研缽、低溫離心機(jī),、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋,。

酶液提?。?/span>

1.  組織：按照質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL蒸餾水）加入蒸餾水,，冰浴勻漿后于4℃,，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測(cè),。

2.  細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；然后4℃，12000rpm離心10min,，取上清置于冰上待測(cè),。

3.  培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1.  根據(jù)樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管,，每支Ep管中放入一個(gè)卷狀濾紙條（注意要放入底部）,，作為底物。2.  對(duì)照管：取200μL滅活的酶液,，加入500μL試劑一,，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中,，標(biāo)注為對(duì)照管,。3.  測(cè)定管：取200μL酶液，加入500μL試劑一,，充分混勻,，再加入放有濾紙條的Ep管中，標(biāo)注為測(cè)定管,。

4.  對(duì)照管和測(cè)定管同時(shí)置于50℃水浴鍋中反應(yīng)30min,。

5.  加入800μL試劑二，沸水浴5min,，自來水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測(cè)定540nm處吸光值,，分別記為A對(duì)照管和A測(cè)定管，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管,。

酶活性計(jì)算公式：

a.     用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.2805x-0.0255,，R²=0.9991

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷W

（3）按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷V樣÷T

=0.891×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷0.2805×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷V樣總）÷T

=0.891×（△A+0.0255）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5mL,，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積,，0.2mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，30min

b.     用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.1403x-0.0255,，R²=0.9991

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每克組織每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷W

（3）按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷V樣÷T

=1.782×（△A+0.0255）

（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下,，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘分解濾紙產(chǎn)生1mg葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷0.1403×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷V樣總）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）

V反總：反應(yīng)總體積，1.5mL,，V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積,，0.2mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，30min

注意事項(xiàng)：

1.  用干凈的鑷子取出濾紙條,，帶手套卷成卷放入Ep管底部。

2.  樣本滅活時(shí)保證同一批樣本處理時(shí)間一致,，建議沸水浴十分鐘,。

3.  批量樣本測(cè)定之前先做1-2個(gè)樣本的預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值超過1.2,，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

顯色后取檢測(cè)液時(shí)注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物,，影響測(cè)定結(jié)果,。