葡萄糖脫氫酶（GCDH）活性檢測試劑盒(紫外分光光度法)

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定,。

產(chǎn)品貨號：BA1248

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H,，主要存在于多種微生物和高等動物的肝臟中。GCDH是一種制備高含量低聚果糖的理想用酶,，同時也是臨床血糖測定的診斷用酶,，可廣泛用于食品工業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中。

GCDH 催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH,，利用NADH在340 nm處吸光值的變化即可反映葡萄糖脫氫酶的活性,。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60 mL×1瓶，4℃保存,。

試劑一：液體50 mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存,。臨用前加入15mL試劑一溶解，用不完的試劑4℃保存,。

試劑三：粉劑×2瓶,，-20℃避光保存。臨用前每瓶加入5mL試劑一溶解,，用不完的試劑建議分裝后-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、臺式低溫離心機(jī)、水浴鍋,、1 mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,，然后，8000 g,，4℃,，離心10 min，取上清置于冰上待測,。

細(xì)胞或細(xì)菌：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬個細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率20%或200 W,，超聲3s，間隔7s,，總時間5min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

血漿（清）：直接檢測,。

二,、測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340 nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、工作液的配制：按照試劑一︰試劑二︰試劑三為4︰3︰2的體積比例充分混勻,，備用，用前37℃預(yù)熱10 min,。

3,、 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、GCDH 酶活計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol 的NADH定義為一個酶活力單位,。

GCDH 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

GCDH 酶活（U/g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =1607.7×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌和細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GCDH 酶活（U/10⁴cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T

=1607.7×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

GCDH 酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=1607.7×ΔA

ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/ mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；10⁹：單位換算系數(shù)， 1mol=10⁹ nmol,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10^-3 L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積,，0.1mL,；V樣總： 加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,，T：反應(yīng)時間：1min。

注意事項：

1,、樣本提取上清液置于冰上待測,，且樣本提取完成后建議當(dāng)天提取當(dāng)天內(nèi)測完。

2,、當(dāng)A1或A2大于1時,，建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。

3,、當(dāng)ΔA大于1時,，建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。