羥脯氨酸（HYP）含量檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1253

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品簡介：

HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一,，膠原蛋白大多分布于皮膚,、腱、軟骨和血管等,，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo),。

樣品經(jīng)酸水解產(chǎn)生游離的HYP，進(jìn)一步被氯胺T氧化,，氧化產(chǎn)物與對二甲氨基甲醛反應(yīng),，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰,。通過測定樣品水解液560nm吸光值,，可計(jì)算HYP含量。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：6mol/L鹽酸,，自備,。濃鹽酸：H₂O（V/V）= 1:1，室溫保存,。

試劑一：液體8mL×1瓶,，4℃避光保存。

試劑二：液體8mL×1瓶,，4℃避光保存,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體0.5mL×1支，0.5mg/mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,，4℃保存,。

需自備的儀器和用品：

天平、烘箱,、玻璃管,、離心機(jī)、水浴鍋,、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L鹽酸和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、羥脯氨酸提取：

1,、組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管,，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉,。加入2mL的提取液,，煮沸或110℃烘箱2至6小時(shí)消化至沒有可見大的團(tuán)塊,，16000rpm，25℃,，離心20min（若離心后仍有雜質(zhì),，可通過過濾去除），用10mol/LNaOH（約1mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8范圍內(nèi),。蒸餾水定容至4mL,，取上清待測。（過程中可能有黑色物質(zhì)生成,，若長時(shí)間不能消化,，可能為碳化的物質(zhì)）

2、細(xì)胞：取500萬個(gè)細(xì)胞,，加入1mL的提取液,，煮沸或110℃烘箱2至6小時(shí)消化至透明狀，16000rpm,，25℃,，離心20min，用10mol/LNaOH（約0.5mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8范圍內(nèi),。蒸餾水定容至2mL,，取上清待測。

二,、測定步驟：

1,、將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為30、15,、7.5,、3.75、1.875,、0.938,、0.469、0.234µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

2,、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至560nm,，蒸餾水調(diào)零,。

3、按下表進(jìn)行操作： 

三,、羥脯氨酸含量計(jì)算公式

1,、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，?A標(biāo)準(zhǔn)（?A =A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）為y軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到方程y=kx+b。將?A測定（?A =A測定管-A空白管）帶入方程得到x,。

2,、羥脯氨酸含量的測定：

（1）按樣本鮮重計(jì)算：

組織羥脯氨酸含量（µg/g鮮重）= x×V樣品÷（W×V樣品÷V組提）=4x÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

組織羥脯氨酸含量（µg/mg prot）= x×V樣品÷（Cpr×V樣品）=x÷Cpr

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

細(xì)胞羥脯氨酸含量（µg/10⁴cell）= x×V樣品÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣品÷V胞提）=2x÷細(xì)胞數(shù)量

V樣品：加入的樣品體積，0.06mL,；V組提：組織提取液體積,，4mL；V胞提：細(xì)胞提取液體積,，2mL,；W：樣本鮮重，g,；細(xì)胞數(shù)量：以10⁴為單位,，萬個(gè)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,。

注意事項(xiàng)：

1、OD值大于1.0,，樣品適當(dāng)稀釋再測定,，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2,、試劑有一定的毒性,，請操作時(shí)做好防護(hù)措施，防止吸入或與皮膚接觸,。

3,、按樣本蛋白濃度計(jì)算時(shí)，需單獨(dú)提取樣本中的蛋白質(zhì)并測定,。