質(zhì)粒大量提取試劑盒 

產(chǎn)品貨號：26243 

產(chǎn)品規(guī)格：10T 

產(chǎn)品簡介：本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞,，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效,、專一地吸附DNA,，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物，一般從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中,，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達85-90%,。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作,，包括酶切、PCR,、測序,、 連接和轉化等試驗。使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇,，加入體積請參照瓶體上的標簽,。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存,。如非指明,，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。產(chǎn)品組成：試劑名稱 10TRNaseA ( 10mg/ml ) 1ml溶液Ⅰ 60ml溶液Ⅱ 60ml溶液Ⅲ 80ml漂洗液 2×15ml洗脫液 30ml吸附柱 10 個收集管(50ml) 10 個

 操作步驟： 

1. 收集 50-100ml 過夜培養(yǎng)的菌液 11000rpm 離心 10 分鐘,，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中),。

   2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (請先檢查是否已加入 RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器*懸浮細菌細胞沉淀,。注意：如果菌塊未*混勻,，會影響裂解導致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

2. 3. 向離心管中加入 5ml 溶液Ⅱ,，溫和地上下翻轉 6-8 次使菌體充分裂解,。

   注意：

   ①翻轉一定要溫和，以免污染細菌基因組 DNA,。

   ②作用時間不要超過 5 分鐘,，以免質(zhì)粒受到破壞。

   4. 向離心管中加入 7ml 溶液Ⅲ ,，立即溫和地上下翻轉 6-8 次,，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過多,，可在此步放置 5 分鐘,，以盡可能的降解 RNA)。11000rpm 離心 10 分鐘,，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中,，注意盡量不要吸出沉淀。

   注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻,，避免產(chǎn)生局部沉淀,。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清,。

   5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中),，室溫放置 2-3 分鐘，11000rpm 離心 30-60 秒,，倒掉收集管中的廢液,，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次),。6. 向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),，11000rpm 離心 2min，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。

   7. 向吸附柱中加入 6ml 漂洗液,，11000rpm 離心 2min，棄廢液,，將吸附柱放入收集管中,。8. 11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數(shù)分鐘,，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除,，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續(xù)的實驗如酶切、PCR 等,。

   9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中,，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經(jīng) 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 5min,，11000rpm 離心 2min,，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實驗。

   10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率,，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中,，室溫放置 5min，11000rpm 離心 2min,。

   注意事項：

   1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁,，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘,，待溶液恢復澄清后再使用,。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應立即擰緊蓋子,。

   2. 洗脫緩沖液體積不應少于 500ul,，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影晌,，若需要用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調(diào)至此范圍),， pH 值低于 7. 0 會降低洗脫效率。 DNA 產(chǎn)物應保存在-20℃,，以防 DNA 降解,。

   3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于 10kb 的大質(zhì)粒,，應加大菌體使用量,，使用 400-800ml 過夜培養(yǎng)物，同時按照比例增加溶液Ⅰ,、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當?shù)难娱L時間,，以增加提取效率,。

   4. DNA 濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒 DNA 純度與樣品保存時間,、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的DNA 可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度,。DNA 應在 OD260 處有顯著吸收峰,，OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、 40μg/ml 單鏈 DNA,。OD260/OD280 比值應為 1.7-1.9,，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水,，比值會偏低,，因為 pH 值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低,。

   保存條件：常溫保存,，復檢期一年。