產(chǎn)品貨號(hào)：10259

 產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞活動(dòng)所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化所產(chǎn)生的能量來(lái)供應(yīng),。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度,，可通過(guò)分級(jí)分離法獲得，即先低俗出去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片,，再進(jìn)行高速梯度離心分離線粒體,。尚寶生物 硬組織線粒體分離試劑盒(Hard Tissue Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離動(dòng)物硬組織(如骨骼肌)中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時(shí)可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白,，可用于分析細(xì)胞色素C等線粒體蛋白向胞漿的釋放,，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測(cè)線粒體膜電位),，獲得的蛋白可用于SDS-PAGE,、Western、雙向電泳等蛋白分析,。該試劑盒適用于從動(dòng)物硬組織(心肌,、骨骼肌)或其他難以分離線粒體的組織中提取線粒體,。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,，不宜用于臨床診斷或其他用途,。產(chǎn)品組成：試劑名稱 50T 100T 保存條件試劑(A): Wash buffer 100ml 200ml -20℃試劑(B): Mitochondria Lysis buffer 50ml 100ml -20℃試劑(C): Mitochondria Stock buffer 50ml 100ml -20℃試劑(D): Protein Stock buffer (5×) 10ml 20ml 室溫試劑(E): PMSF(100×) 1.5ml 3ml -20℃ 

自備材料： 

1. 低溫離心機(jī)、勻漿器

2. 尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩 

操作步驟 (僅供參考) ： 

1. 清洗：動(dòng)物禁食 24h 后處死,，取新鮮橫紋肌等組織,，迅速稱重 50～100mg，用預(yù)冷的 Wash buffer 清洗 2 次,，棄 Wash buffer,，冰上剪成 30mm 大小的組織碎片。

2. 裂解：加入 10 倍體積的預(yù)冷的 Mitochondria Lysis buffer,，置于冰浴 5～10min,。

 3. 勻漿Ⅰ：轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 Dounce 勻漿器中，勻漿 10～20 次,，或采用電動(dòng)勻漿器,，700rpm，8～10 次,。不同組織或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同,，需自行優(yōu)化。

 4. 勻漿Ⅱ：4℃攪拌孵育 5～10min,。用等體積的 Mitochondria Stock buffer 秲釋至勻漿液,，再次重復(fù)步驟 3。

 5. 離心：用尼龍網(wǎng)或細(xì)胞篩過(guò)濾勻漿液,，4℃,，1000g 離心 15min，重復(fù) 1 次,，以去除細(xì)胞核,、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。注：如需獲得純度更高的線粒體,，可以將此步驟的離心速度改為 2000g 離心 10min,，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降。 

6. 上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管,，4℃ 12000g 離心 10min,。

注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為 6000g 離心 10min,，其缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會(huì)下降,。

 7. 棄上清，沉淀為線粒體,，如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白,，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時(shí)注意勿觸及沉淀,。隨后把收集的上清 12000g,，4℃離心 10min,，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。 

8. 保存：棄上清,，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀,。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于Mitochondria Stock buffer,；如果用于線粒體蛋白的分析,，獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于 1×Protein Stock buffer，即按細(xì)胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=1:4 比例混合,；如果用于雙向電泳,，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸?nbsp;

注意事項(xiàng)：

 1. 試劑 (如 PMSF)對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)不必全部使用，在實(shí)驗(yàn)條件成熟后可以不必使用,。

 2. 如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 不必加入 PMSF,。如果用于制備線粒體蛋白樣品,，Mitochondria Lysis buffer 和 Mitochondria Stock buffer 需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入,，以免 PMSF 在水溶液中很快失效,。

 3. 分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或 4℃預(yù)冷,，全部操作時(shí)間盡量控制在 1h 以內(nèi),。

 4. 通常在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取 1000g 和 12000g，如果希望純度更高,，但對(duì)線粒體的得率要求不高,，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。 

有效期：12 個(gè)月有效,。