一步法感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒 

產(chǎn)品貨號(hào)：11127 

產(chǎn)品規(guī)格：100T/500T 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

一步法感受態(tài)細(xì)菌制備試劑盒(One Step Competent Cell Preparation Kit) 是一種用于大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌快速制備的試劑盒,。是在經(jīng)典的TSS法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)改良而成,，既繼承了TSS法的快速和簡(jiǎn)便，又在此基礎(chǔ)上提高了感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率和易操作性,。使用本試劑盒可以使感受態(tài)效率達(dá)到106以上,。不僅可以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，而且可以轉(zhuǎn)化普通的連接產(chǎn)物,。另外,，對(duì)細(xì)菌的培養(yǎng)條件要求比較寬松，培養(yǎng)的細(xì)菌只要處于對(duì)數(shù)期內(nèi)就可以使用本試劑盒制備感受態(tài)細(xì)菌,。使用本試劑盒操作非常簡(jiǎn)單,，細(xì)菌培養(yǎng)好后僅需十幾分鐘就可以完成感受態(tài)細(xì)菌的制備。本試劑盒適用于絕大部分常見的大腸桿菌,，包括DH5α,、JM109、TG1,、HB101和XL-1等。對(duì)于一些用于蛋白表達(dá)或病毒質(zhì)粒構(gòu)建的特殊大腸桿菌也適用,，制備出來的感受態(tài)菌轉(zhuǎn)化質(zhì)?？隙]有問題，但如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物有時(shí)效果不如DH5α等其它常見的細(xì)菌,。本試劑盒提供了DH5α甘油菌作為菌種,，可以用于制備感受態(tài)細(xì)菌。本試劑盒可以分多次使用,，共可以制備足夠進(jìn)行200-400次轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌,。 

產(chǎn)品組成：試劑名稱 100T 500T感受態(tài)制備試劑 5ml 25mlDH5α甘油菌 100μl 500μl 

使用說明：

 1. 涂平板： 

為取得最佳的感受態(tài)效率，必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂 LB 平板,，并培養(yǎng)過夜,。

 2. 接種：

 取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的 LB 平板，后續(xù)操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行,。把鑷子的頂端在 70%酒精中蘸一下,，并在酒精燈上略略燒一下，使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài),。用鑷子夾取一個(gè)無菌的塑料槍頭或牙簽,，從平板上挑取一個(gè)單克隆,，然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有 3 毫升 LB 的細(xì)菌培養(yǎng)試管內(nèi)。上述操作也可以使用接種環(huán)等進(jìn)行操作,。 

3. 培養(yǎng)： 

37℃約 200rpm 培養(yǎng)過夜,，通常培養(yǎng)時(shí)間控制在 16 小時(shí)左右為宜。絕對(duì)不宜超過 18 小時(shí),。

 4. 再接種培養(yǎng)：

 根據(jù)需要制備的感受態(tài)細(xì)菌的量,，按照 1:100 的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取 500 微升的新鮮過夜菌到 50 毫升的 LB 中繼續(xù) 37℃約 200rpm 培養(yǎng),。通常在大約培養(yǎng) 2-2.5 小時(shí)后 OD600 可以達(dá)到 0.3-0.5,。 

5. 制備感受態(tài)細(xì)菌： 

在培養(yǎng)的細(xì)菌 OD600 達(dá)到 0.3-0.5 時(shí)，4℃2000g 離心 5 分鐘收集細(xì)菌,。 如果離心沉淀前的菌量為 50 毫升,，按后續(xù)操作進(jìn)行，如果是其它體積則按比例換算后進(jìn)行后續(xù)操作,。用 5 毫升預(yù)冷的 LB 重新懸浮起細(xì)菌沉淀,，加入 5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態(tài)制備試劑，混勻,，冰浴放置 5 分鐘,。然后再輕輕混勻，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)分裝到 1.5 毫升或 0.5 毫升的離心管內(nèi)后-70℃保存,。注：如果以后會(huì)只做單管的轉(zhuǎn)化,，可以分裝成每管最少 50 微升或 100 微升，如果以后一次性做多個(gè)轉(zhuǎn)化,，可以每管分裝 500 微升或更大體積,。-70℃保存后，感受態(tài)的效率會(huì)隨時(shí)間的推移逐漸下降,，但通常在半年內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率下降不會(huì)太多,。總的來說,，新鮮制備的感受態(tài)要比凍存的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率更高一些,。 

6. 感受態(tài)細(xì)菌的使用：

 a.對(duì)于感受態(tài)細(xì)菌效率的測(cè)定或連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(其它如基因突變產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化等參考連接產(chǎn)物進(jìn)行)：

 (a)在冰上緩慢融解感受態(tài)細(xì)菌(對(duì)于新鮮制備的感受態(tài)就可以直接使用了)，如果檢測(cè)感受態(tài)細(xì)菌的效率,，加入100pg-10ng 質(zhì)粒,，但質(zhì)粒的體積不宜超過感受態(tài)細(xì)菌量的 10%。如果轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物,，每 100 微升感受態(tài)細(xì)菌加入10 微升連接產(chǎn)物,。

 (b)輕輕用手指彈動(dòng)離心管，以混勻細(xì)菌和質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物,。冰浴或冰水浴放置 30 分鐘,。

 (c)42℃水浴，熱休克 2 分鐘,。 

(d)熱休克后立即置于冰水浴中,，2 分鐘。 

(e)加入 900 微升 LB,，37℃200rpm 培養(yǎng) 1 小時(shí),。(f)如果檢測(cè)感受態(tài)效率，取 100 微升涂布到含有相應(yīng)抗生素的 LB 平板上,。如果轉(zhuǎn)化的是連接產(chǎn)物,，2000-3000g離心 1 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間使細(xì)菌充分沉淀下來。去除約 900-950 微升 LB 培養(yǎng)液,。細(xì)菌沉淀用余下的 LB 培養(yǎng)液重懸,，然后全部涂布到含有適當(dāng)抗生素的 LB 平板上。37℃培養(yǎng)過夜,。 

b.對(duì)于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：

 (a)融解感受態(tài)細(xì)菌,，加入不少于 50ng 質(zhì)粒到 50 或 100 微升感受態(tài)細(xì)菌中。質(zhì)粒的量可以是 1 微克或更多,，但體積不宜超過感受態(tài)細(xì)菌量的 10%,。

 (b)輕輕用手指彈動(dòng)離心管，以混勻細(xì)菌和質(zhì)粒,。冰浴或冰水浴放置 10 分鐘,。

 (c)取全部菌液直接涂布到含有適當(dāng)抗生素的 LB 平板上，37℃培養(yǎng)過夜,。

 注意事項(xiàng)：

 需自行配制 LB 液體培養(yǎng)基和 LB 平板以用于細(xì)菌的培養(yǎng)和感受態(tài)效率的檢測(cè),。盡管經(jīng)過我們的測(cè)試凡是處于對(duì)數(shù)期內(nèi)的細(xì)菌都可以用于感受態(tài)細(xì)菌的制備，但如果細(xì)菌生長(zhǎng)的 OD600 的值達(dá)到 0.3-0.5 左右時(shí),，制備出來的感受態(tài)效果較佳。在制備感受態(tài)細(xì)菌的過程中均使用不含抗生素的 LB,。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的 37℃培養(yǎng)時(shí)也必須使用無抗生素的 LB,，即便轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒是有抗性的。本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,，不得用于臨床診斷或治療,，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi),。為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 有效期：-20℃保存,，一年有效,。