產(chǎn)品名稱：線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）

產(chǎn)品貨號：10235 

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T 

產(chǎn)品簡介：

線粒體膜電位檢測試劑盒是一種以JC-1為熒光探針,，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒,，可以用于早期的細胞凋亡檢測,。 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針?？梢詸z測細胞,、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時,，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中,，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光,；在線粒體膜電位較低時,，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體,，可以產(chǎn)生綠色熒光,。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例,。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件,。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標,。JC-1單體的最大激發(fā)波長為515nm ,，最大發(fā)射波長為529nm ；JC-1聚合物的最大激發(fā)波長為585nm,，最大發(fā)射波長為590nm,。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可,。本試劑盒提供了CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照,。對于六孔板中的樣品,，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品,，本試劑盒共可以檢測200個樣品,。

 產(chǎn)品組成：

 產(chǎn)品組成 規(guī)格JC-1（200×） 100μ L/管，共5管超純水 90mLJC-1染色緩沖液（5×） 80mLCCCP（10mM ） 20μL 

操作步驟（僅供參考）：

 1. JC-1染色工作液的配制：六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL,，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推,；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mL JC-1染色工作液。取適量JC-1（200×）,，按照每50μL JC-1（200 ×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1,。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1 。然后再加入2mL JC-1染色緩沖液（5 ×）,，混勻后即為 JC-1染色工作液,。 

2. 陽性對照的設置：把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1：1000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM,，處理細胞20分鐘,。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測,。對于大多數(shù)細胞,，通常10μM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會*喪失，JC-1染色后觀察應呈綠色熒光,；而正常的細胞經(jīng)JC-1染色后應顯示紅色熒光,。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同,，需自行參考相關 文獻資料決定,。

 3. 對于懸浮細胞： 

（1）取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中,，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅,。 

（2）加入0.5mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻,。細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20分鐘,。 

（3）在孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例,，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×）,，并放置于冰浴。 

（4）37℃孵育結(jié)束后,，600g 4℃離心3～4分鐘,，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞,。

 （5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞,，600g 4 ℃離心3～4分鐘，沉淀細胞,，棄上清,。再加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4 ℃離心3～4分鐘,， 沉淀細胞,，棄上清。 

（6）再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后,，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

 4. 對于貼壁細胞：

 注意：對于貼壁細胞,，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測,，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法,。 

（1）對于六孔板的一個孔,，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次,，加入1mL細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。

 （2）加入1mL JC-1染色工作液,，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘,。 

（3）在孵育期間,，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×）,，并放置于冰浴,。

 （4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清,，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次,。 

（5）加入2mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。 

（6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察,。

 5. 對于純化的線粒體： 

（1）把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。

 （2）0.9mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100 μg純化的線粒體,。

 （2）用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan）,，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標儀,，激發(fā)波長不能設置為485nm時,，可以在475～520nm范圍內(nèi)設置激發(fā)波長。另外,，也可以參考下面步驟6中的波長設置進行熒光檢測,。 

（3）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。 

6. 熒光觀測和結(jié)果分析：檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設置為490nm,，發(fā)射光設置為530nm,；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設置為525nm,，發(fā)射光設置為590nm,。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察,，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置,，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光,，如碘化丙啶或Cy3時的設置,。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期,。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常,，細胞的狀態(tài)也比較正常。

 注意事項：

 1. JC-1（200×）在4℃,、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底,、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用,。

 2. 必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后,，才可以加入 JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×）,，這樣JC-1會很難充分溶解,，會嚴重影響后續(xù)的檢測。 

3. 裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時,，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右,，此時的洗滌效果較好。

 4. JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測,。在檢測前需冰浴保存,。 

5. 請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）,。

 6. 如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀,，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。

 7. CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑,，有毒,，請注意小心防護。

 8. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。 

保存條件：-20℃避光保存，盡量避免反復凍融,，有效期一年,。

超純水和JC-1染色緩沖液（5 ×）也可4℃保存。