產(chǎn)品貨號：R21806

產(chǎn)品規(guī)格：50T

細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒產(chǎn)品簡介：

尚寶生物 細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶 染色 (PI staining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析的檢測試劑盒,。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種可以嵌 合到雙鏈DNA和RNA的堿基對中并與之結(jié)合的熒光染料，無堿基特異性,。碘化丙啶與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生 熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比,。細胞內(nèi)的DNA被Propidium Iodide染色后,，可以用流式細胞儀對 細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況,，可以進行細胞周期和細胞凋亡的分析。碘化丙啶染色 后,，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2,，正在 進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1～2之間,。凋亡細胞由于細胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA的片段化 (DNAfragmentation)導致部分基因組DNA的片斷在染色過程中丟失,，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染， 即熒光強度小于1,，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰,，即凋亡細胞峰,。

細胞凋亡時，流式細胞檢測可呈現(xiàn)亞二倍體核型的特征,，根據(jù)光散射的特點，PI染色可以區(qū)分細胞凋亡和細 胞壞死的細胞峰型,。細胞凋亡時,，出現(xiàn)凋亡細胞皺縮、染色質(zhì)濃縮,、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體,，使細胞的前向光散 射低于正常。在細胞凋亡的早期,，細胞對前向角光散射的能力顯著降低,，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化,。 在細胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號均降低,。細胞壞死時細胞多表現(xiàn)為細胞腫脹,，因此前向光散射高于 正常，對側(cè)向光散射高于正常,。

尚寶生物 Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit經(jīng)常用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測， 亦可用于區(qū)分細胞凋亡和細胞壞死,。該試劑盒檢測細胞含量范圍一般為0.1～1×10 6之間。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 胰蛋白酶消化液

2. 流式細胞儀

3. PBS

4. 預冷固定液：預冷的 70%乙醇或 4%多聚甲醛

操作步驟(僅供參考)：

1. 細胞樣品的制備：

⑴貼壁細胞：

① 小心收集細胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內(nèi)備用,。

② 用胰蛋白酶消化細胞至可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,，吹打下所有的 名稱 50T 保存條件 試劑(A): PI Stain Buffer 25ml -20℃ 試劑(B): PI Stain(20×) 1.5ml -20℃，避光 試劑(C): RNase A Solution(50×) 0.5ml -20℃ 貼壁細胞,，并輕輕吹散細胞。

③ 收集上述細胞懸液到離心管內(nèi),。

④ 4℃,，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底,。小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞,。

⑤ 加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞,，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管。

⑥ 4℃,，1000g 離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

⑦ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS,，以免吸走細胞。

⑧ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,，避免細胞成團。

⑵懸浮細胞：

① 4℃,，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液,，以免吸走細胞。

③ 加入約1ml 提前預冷的PBS,，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管,。

④ 4℃,，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

⑤ 小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl PBS，以免吸走細胞,。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團,。

2. 細胞的固定：

加入1ml冰浴預冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻,，4℃條件下固定2h或更長時間,。4℃固定12～24h 可能效果更佳,。

3. 細胞的清洗：

① 4℃，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底。

② 小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl溶液,，以免吸走細胞。

③ 加入約1ml提前預冷的PBS,，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管,。

④ 4℃,，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl PBS,，以免吸走細胞,。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,，避免細胞成團。

4. PI 染色：

⑴ 一步法：

①PI 染色工作液的配制：根據(jù)待檢樣品的數(shù)量,，取適量試劑(A)、試劑(B),、試劑(C)混合形成PI染色工作液,。配 制好的PI染色工作液4℃避光保存待用,，24h有效。

                                                                           1個樣品                     10個樣品

       試劑(A): PI Stain Buffer                                  500ul                       5ml

       試劑(B): PI Stain(20×)                                      25ul                       250ul

       試劑(C): RNase A Solution(50×)                      10ul                       100ul

       總量                                                                 535μl                     5.35ml

②在每個待檢細胞樣品中,，加入500μl配制好的PI染色工作液，輕輕重懸細胞沉淀,，置于37℃避光水浴 30min。

⑵ 兩步法：

①在沉淀細胞中加入40μl PBS和10μl RNase A Solution(50×),，置于37℃水浴30min,。

②PI染色工作液的配制：根據(jù)待檢樣品的數(shù)量,，取適量試劑(A)、試劑(B)混合形成PI染色工作液,。配制好的 PI 染 色工作液4℃避光保存待用,，24h有效,。

                                                                               1個樣品                       10個樣品

                   試劑(A): PI Stain Buffer                           500ul                            5ml

                   試劑(B): PI Stain(20×)                             25ul                              250ul

                   總量                                                        525μl                            5.25ml

③在每個待檢細胞樣品中，加入500μl配制好的PI染色工作液,，輕輕重懸細胞沉淀，置于4℃避光30min,。

5. 檢測與分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光,，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟 件進行細胞DNA含量分析和光散射分析,。

染色結(jié)果：

凋亡細胞G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細胞群的峰型，在光散射譜上，前向光散射低于正常,，側(cè)向光散射 高于正常,。

注意事項：

1. 熒光染料都存在淬滅的問題,，建議染色后盡快檢測。

2. 為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液,。

3. 在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中,，對于特殊細胞,，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長離 心時間,。