自備材料：

1. 胰蛋白酶消化液

2. 流式細胞儀

3. PBS

4. 預冷固定液：預冷的70%乙醇或4%多聚甲醛

操作步驟（僅供參考）：

1. 細胞樣品的制備：

⑴貼壁細胞：

① 小心收集細胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內(nèi)備用,。

② 用胰蛋白酶消化細胞至可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,，吹打下所有的 貼壁細胞,，并輕輕吹散細胞。

③ 收集上述細胞懸液到離心管內(nèi),。

④ 4℃,，1000g離心3～5min，使細胞沉到管底,。小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細胞,。

⑤ 加入約1ml提前預冷的PBS,，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管,。

⑥ 4℃,，1000g離心3～5min，使細胞沉到管底,。

⑦ 小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl PBS,，以免吸走細胞。

⑧ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞,，避免細胞成團,。

⑵懸浮細胞：

① 4℃，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液,，以免吸走細胞,。

③ 加入約1ml提前預冷的PBS，重懸細胞,，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管,。

④ 4℃，1000g 離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

⑤ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS,，以免吸走細胞,。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團,。

2. 細胞的固定：

 加入1ml冰浴預冷70%乙醇中,，輕輕吹打混勻，4℃條件下固定2h或更長時間,。4℃固定12～24h 可能效果更佳,。

3. 細胞的清洗：

①4℃，1000g 離心3～5min,，使細胞沉到管底,。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl溶液,，以免吸走細胞。

③ 加入約1ml提前預冷的PBS,，重懸細胞,，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管。

④4℃,，1000g離心3～5min,，使細胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄,，可留大約50μl PBS,，以免吸走細胞,。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團,。

4. PI染色：

 在每個待檢細胞樣品中加入500μl配制好的PI染色工作液,，輕輕重懸細胞沉淀，置于37℃避光水浴 30min,。

5. 檢測與分析：

 用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光,，同時檢測光散 染色結(jié)果： 凋亡細胞G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細胞群的峰型，在光散射譜上,，前向光散射低于正常,，側(cè)向光散射高于正常。

注意事項：

1. 熒光染料都存在淬滅的問題,，建議染色后盡快檢測,。

2. 為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。

3. 在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中,，對于特殊細胞,，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長離 心時間,。

4. 如果用于組織的細胞周期不細胞凋亡檢測,，則必須把組織消化后，制備成單細胞懸液,，才可以進行檢測,。

5. 細胞凋亡時，凋亡細胞的標志之一是DNA可染行降低,，但這種情況并是的,，DNA含量的降低或者 DNA 與染料結(jié)合能力下降也會導致 DNA 可染行降低，在分析的時候應特別注意,。

6. PI對人體有一定刺激性,，請注意適當防護。

7. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

有效期： -20℃儲存，6個月有效,。4℃儲存, 1 個月有效,。