谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(微板法)

產(chǎn)品貨號：BA1823

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡介：

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,，GSH-Px)是一種含硒的水溶性四聚體蛋白酶,。幾平在所有組織中都有分布，在一些病理狀況下谷胱甘肽過氧化物酶的活力會發(fā)生明顯的變化,，該酶可以清除活細(xì)胞內(nèi)過氧化物,，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷過程中起著關(guān)鍵作用,。細(xì)胞內(nèi)的脂類容易和自由基發(fā)生反應(yīng),，產(chǎn)生脂類過氧化物,。谷胱甘肽過氧化物酶不僅具有消除自由基和衍生物的作用，還與過氧化氫酶(CAT),、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PH-GSH-Px),、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)構(gòu)成不同基質(zhì)特異性的多水平的還原有機(jī)氫過氧化物系統(tǒng)，減少脂質(zhì)過氧化物的形成,，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷能力,。

谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(Glutathione Peroxidase AssayKit)是一種以過氧化氫為底物，通過微板法檢測細(xì)胞,、組織或其它樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活性的試劑盒,。絕大部分細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶都是含硒的，且硒為該酶的活性中性組成部分,。細(xì)胞內(nèi)也有棲少量的不含硒的谷胱甘肽過氧化物酶存在,。本試劑盒檢測的是最常見的含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，該檢測法的缺點(diǎn)谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)催化過氧化氫以及許多有機(jī)過氧化物,，產(chǎn)生水或有機(jī)醇,，在特殊情況下會影響檢測準(zhǔn)確性。硒是GSH-Px的必須組成部分,，每分子該酶含有含有四分子硒,，該酶的活性中心是硒半胱氨酸，測定該酶的活力可以衡量有機(jī)體硒水平,。其檢測原理是：GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)與苯甲酸顯色液發(fā)生氧化反應(yīng),，使之生成黃色陰離子，通過酶標(biāo)儀檢測422nm處吸光度值測定該陰離子的濃度,，間接推算GSH減少的量,。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途,。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 生理鹽水或PBS

2. 離心管,、1.5mlEP管或96孔板

3. 酶標(biāo)儀

4. 水浴鍋或恒溫箱

5. 離心機(jī) 

 操作步驟(僅供參考):

1. 樣本處理:

a.血清,、血漿樣本：從待測樣本中分離出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有,，應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測,，如超過檢測范圍，用生理鹽水稀釋后檢測,。血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下:

用抗凝管收集血液,，顛倒混勻,。取至少500ul全血，4℃ 3000g離心5min,。棄上清,，用預(yù)冷的10倍體積的樣品勻漿液重懸紅細(xì)胞沉淀，再同前離心,，棄上清,。加入約4倍體積預(yù)冷的ddH2O裂解紅細(xì)胞沉淀， 12000 r/min 離心5min,，取上清；亦可采用ACK紅細(xì)胞裂解液等去除紅細(xì)胞,，取上清,。

b.組織樣本：動物用含有20U/ml heparin的生理鹽水(0.9%NaCl containing20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每20mg組織加入200ul樣品勻漿液的比例,，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿,。4℃，12000g離心10min,。取上清用于酶活性的測定,。

c.細(xì)胞樣本：對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定,，避免使用胰酶消化細(xì)胞,。可以使用細(xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞收集細(xì)胞,。細(xì)胞用PBS或生理鹽水洗滌1次,。按照每10⁶細(xì)胞加入300-500ul勻漿液的比例用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃12000g離心10min,，取上清用于酶活性的測定,。亦可采用Western及IP細(xì)胞裂解液參考相應(yīng)說明裂解細(xì)胞樣品，按照每10⁶細(xì)胞加入100-200u1裂解液的比例進(jìn)行裂解,，取上清用于酶活性的測定,。

d.植物樣本：稱取0.2g新鮮樣品或-80℃凍存的樣品，放入預(yù)冷的研缽中,，加入2ml 預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.05M,，pH7.0），在冰浴上研磨或勻漿,，轉(zhuǎn)入離心管,，4℃ 12000r/min 離心10~15min，取上清,，用于酶活性的測定,。

2. GSH工作液的配制：取0.5ml ddH20加入15.4mgGSH中，充分溶解開混勻，即獲得GSH儲存液(100mmol/L),，立即分裝后-20℃保存,。取適量的GSH儲存液(100mmol/L)，按GSH配制液：GSH儲存液(100mmol/L)=99:1的比例稀釋至1mmol/L,，即為GSH工作液(1mmol/L),，該溶液配制好以后可4℃保存1天。

3. 氧化工作液的配制：準(zhǔn)確取氧化劑0.1ml加入6.5ml ddH20,，即為氧化儲存液(100×),，4℃保存。臨用前,，準(zhǔn)確取氧化儲存液(100×)0.1ml加入6.5ml ddH2O,，即為氧化儲存液 (100×)，4℃保存,，臨用前準(zhǔn)確取氧化儲存液(100×)0.1ml 加入 9.9ml ddH2O,，即為氧化工作液；4℃保存,，1天有效,。

4. GSH-Px酶促反應(yīng)：可參考下表設(shè)置檢測反應(yīng)體系，依次加入試劑：

5. GSH-Px顯色反應(yīng)：可參考下表設(shè)置檢測反應(yīng)體系，依次加入試劑：

6. GSH-Px測定：混勻,，置于室溫孵育1min,，以ddH2O調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測422nm處吸光度(即為A空白,、A本底,、A測定）；如果用酶標(biāo)儀96孔板每孔應(yīng)加250μl,；如果用分光光度計,，比色杯光徑應(yīng)為1cm，加入的量應(yīng)根據(jù)比色杯的最小量程而定,；經(jīng)測定,，一般情況下A空白在0.003~0.05之間，A本底在0.1~0.3左右,。

計算:

谷胱甘肽過氧化物酶酶活力單位的定義：排除非酶促反應(yīng),，在37℃，每1L血清,，1min內(nèi)可以催化1μmol GSH 氧化所需(減少)的酶量為一個GSH-Px活性單位,。

GSH-Px(U/L)=(A本底-A測定)/(A本底-A空白)×200

式中：A空白=空白對照的吸光度

A本底=本底對照的吸光度

A測定=待測樣品的吸光度

200=1000(ml)/5(min)

注：a,、[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力的單位為U/L=mU/ml。

b,、樣品(如組織樣本)中谷胱甘肽過氧化物酶活力=[檢測體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]×稀釋倍數(shù)/樣品中的蛋白濃度]

[樣品中(如組織樣本)谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為:U/mg或mU/mg蛋白樣品中的蛋白濃度1的單位為:mg/ml,。

c、計算示例：樣品的蛋白濃度經(jīng)測定為05mg/ml,，稀釋2倍后進(jìn)行測定,。一般情況下，A空白在0.003~0.05之間,，A本底在0.10~0.3左右,。如果A本底＝0.30，A測定＝0.20,，A空白＝0.003 那么:

液體樣本 GSP-Px活力=(0.30-0.2)/(0.30-0.003)×200×2=134.7U/L

組織樣本 GSP-Px活力=134.7U/L×2/(0.5mg/ml)=538.8mU/mg(蛋白)

參考區(qū)間：成年人血清GSP-Px：115~140 U /L

注意事項(xiàng)：

1. 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融,，以免失效或效率下降。

2. 本法中所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定,，如果在樣品中的還原劑無法避免，例如DTT,、巰基乙醇等,，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM；0.15mM的DTT可以抑制 40%的酶活力,。

3. 常用的 Triton X-100,、Tween 20等去垢劑都含有較高水平的過氧化物，會影響本試劑盒的測定,，如果必須使用這些去垢劑,，最好使用純度較高并注明含較低濃度過氧化物的去垢劑。

4. 樣品取出后最好立即測定,，也可以-80℃凍存待以后測定,。

5. 一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時的溫度，否則會引起較多誤差,。

有效期：12個月有效,。