如何生產(chǎn)mRNA,？

時(shí)間：2023/8/29閱讀：703

mRNA(信使核糖核酸)疫苗是一種能夠激發(fā)人體自身對(duì)特定抗原免疫反應(yīng)的新型技術(shù),，它攜帶有mRNA的信息,，其中包括特定病毒特征（即病毒抗原）的“藍(lán)本"或者代碼。這些信息使人體能夠自行合成病毒抗原：mRNA將生產(chǎn)抗原所需的信息輸送到人體制造蛋白的細(xì)胞機(jī)器中,，然后,，人體細(xì)胞將抗原呈遞到細(xì)胞表面，從而誘導(dǎo)所需的特定免疫反應(yīng),。當(dāng)人體接觸到對(duì)應(yīng)的病毒時(shí),，免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別出特定抗原，從而精準(zhǔn)且迅速地攻擊病毒來(lái)阻止感染,。

mRNA的生產(chǎn)過(guò)程——

1、DNA原液制備,；

我們首先需要設(shè)計(jì)與構(gòu)建含有S蛋白基因序列的載體,，然后通過(guò)大腸桿菌放大培養(yǎng)，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒,。

2,、mRNA原液的制備；

獲取的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒線(xiàn)性化{（噬菌體啟動(dòng)子（T7）-5 UTR-開(kāi)放閱讀框（ORF）-3 個(gè)非翻譯區(qū)（UTR）-polyA}通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄（IVT）將前mRNA5'端加帽子,。后續(xù)需要經(jīng)過(guò)一系列的純化,，除菌等過(guò)程,。除去酶、游離核苷酸,、殘留 DNA 和外源 RNA 片段,，dsRNA, 及反應(yīng)體系中的免疫原性雜質(zhì)。滿(mǎn)足 GMP 生產(chǎn)的質(zhì)量需求,。

Moderna的mRNA還需要把尿苷替換成假尿苷,，以降低免疫原性。

3,、利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封,。

制備遞送系統(tǒng)，例如基于聚合物或脂質(zhì)的納米顆粒(LNP),，然后使用不同制造商不同的方法將純化的mRNA封裝在其中,。由此產(chǎn)生的mRNA/遞送納米顆粒組件經(jīng)過(guò)濃縮、緩沖液交換和無(wú)菌過(guò)濾,。然后最終評(píng)估并按此順序包裝成袋/瓶作為原料藥,。原料藥通常在最終形成（盡管不適用于某些工藝）最終藥物產(chǎn)品填充之前冷凍儲(chǔ)存，在某些情況下隨后還需要進(jìn)行凍干,。

在NGS及合成技術(shù)的快速發(fā)展的今天,，病毒遺傳信息序列的解讀及序列合成已不是難題。如何將合成好的mRNA序列遞送進(jìn)入人體細(xì)胞變成了mRNA疫苗研發(fā)的重要挑戰(zhàn)之一,。

人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)從外至內(nèi)可分為細(xì)胞膜（cell membrane）,、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、細(xì)胞核（nucleus）,。mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,，因此，mRNA疫苗要發(fā)揮作用,，必須先將編輯好的mRNA遞送進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中,。

進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)需要通過(guò)細(xì)胞膜，細(xì)胞膜由磷脂雙分子層構(gòu)成,，磷脂分子頭部具有親水性,，尾部具有疏水性，兩層磷脂尾部相對(duì)形成雙分子層,，能夠有效控制水分子,、離子、大分子物質(zhì)通過(guò),。mRNA作為大分子（300-5000kDa）,，在不破壞細(xì)胞膜的前提下，進(jìn)出細(xì)胞只能以?xún)?nèi)含體（endosome）通過(guò)胞吞作用（endocytosis）,。

通常情況下,，內(nèi)含體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,，會(huì)被直接送至溶酶體（lysosome）進(jìn)行分解。為保證mRNA在翻譯前保持完整性,，mRNA需要在內(nèi)含體與溶酶體結(jié)合前打破內(nèi)含體包膜（endosomal disruption）并逃離,。

逃離內(nèi)含體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，mRNA便會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游動(dòng),，直至到達(dá)核糖體（ribosome）并在此轉(zhuǎn)譯為肽鏈,，最終折疊成為蛋白質(zhì)。

對(duì)于mRNA疫苗和藥物,，遞送系統(tǒng)有兩大職責(zé)：

1,、有效包裹和保護(hù)mRNA在到達(dá)靶點(diǎn)前維持穩(wěn)定，

2,、幫助mRNA有效成分進(jìn)入細(xì)胞,，

3、在mRNA到達(dá)溶酶體前將其釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,。

LNP是目前有潛力的遞送載體之一,。LNP（Lipid Nanoparticle）是脂質(zhì)微粒的總稱(chēng)，其中又包括脂質(zhì)膠團(tuán)（micelle）,、脂質(zhì)體（liposome）等,。LNP與細(xì)胞膜的組成成分相似，均由脂質(zhì)分子構(gòu)成,。脂質(zhì)分子的兩條長(zhǎng)尾通常呈平行狀態(tài),，在此狀態(tài)下，脂質(zhì)形成的雙分子層穩(wěn)定,。

在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)酸性環(huán)境后,，部分脂質(zhì)的頭部質(zhì)子化，呈現(xiàn)陽(yáng)離子形態(tài),，與其他陰性離子態(tài)的脂質(zhì)分子相吸引,，尾部張開(kāi)。原本雙分子層的形式被破壞,，形成頭部聚集在一起的環(huán)狀,。之前包裹在內(nèi)的mRNA便可逃逸出內(nèi)含體，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)翻譯,。

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