不同蛋白濃度測定方法優(yōu)缺點(diǎn)

時(shí)間：2022/3/7閱讀：10526

1. BCA法測定試劑盒

堿性條件下,，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物,，測定其在562nm處的吸收值,，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比,，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。不方便的是這種方法需要提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,。BCA蛋白質(zhì)測定方法靈敏度高,，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳,。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測,，可兼容高達(dá)5%的SDS，TritonX-100及Tween等,。然而,，由于BCA方法依靠銅離子進(jìn)行顯色反應(yīng)，如果溶液中含有與銅離子反應(yīng)的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT,、β-巰基乙醇,，結(jié)果將受到很大程度的影響。同時(shí),，BCA方法的檢測結(jié)果也會受到蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸，酪氨酸,，色氨酸含量的影響,。

2. Bradford法

該方法的原理是，帶負(fù)電的考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用,?？捡R斯亮藍(lán)在溶液中顯紅色，吸收峰在465nm處,，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,，其顯藍(lán)色，在595nm處有吸收峰,。595nm處的吸光值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比,。

Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M,，二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá)5mM,。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%,，Triton X-100低于0.1%,，Tween 20, 60, 80低于0.06%。

3. UV280法

這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì),。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快,，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,。

1）簡易經(jīng)驗(yàn)公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

2）精確計(jì)算

通過計(jì)算OD280/OD260的比值,，然后查表得到校正因子F，再通過如下公式計(jì)算最終結(jié)果：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數(shù)

4. Lowry法

蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合,，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物,，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物,，在一定條件下,，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

5,、考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）法

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度,，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速,、靈敏的方法,。

考馬斯亮藍(lán)G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色,。它和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law）,。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式,，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量,。

蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個(gè)很快的過程,，約2min即可反應(yīng)*，呈現(xiàn)最大光吸收,，并可穩(wěn)定1h,，之后,，蛋白質(zhì)―染料復(fù) 合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì)―染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù),，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高,，在測定溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍,，測定范圍為10-100µg蛋白質(zhì),，微量測定法測定范圍是1－10µg蛋白質(zhì)。此反應(yīng)重復(fù)性好,，精確度高,，線性關(guān)系好。標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲,，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊,，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結(jié)合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕,，不影響測定,。

此方法干擾物少，研究表明：NaCl,，KCl,，MgCl2，乙醇,，（NH4）2SO4無干擾。強(qiáng)堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾,，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對照扣除其影響,。Tris，乙酸,，2―巰基乙醇,，蔗糖，甘油,，EDTA及微量的去污劑如 Triton X―100,，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾,，用適當(dāng)?shù)木彌_液對照很容易除掉,。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除,。

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