如何擺脫qpcr苦惱,，得到更好的結(jié)果

時間：2022/3/3閱讀：1352

什么是熒光定量PCR,？

指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個
PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見",，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進行定量的方法,。

定量PCR原理？

與傳統(tǒng)PCR一樣,反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進行,；理論上每經(jīng)過一個循環(huán)目的基因的數(shù)量都會增加一倍,；每個循環(huán)結(jié)束后,定量PCR儀器通過不同的濾光片記錄熒光信號,；在擴增過程中,熒光信號隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強。

定量PCR體系,？

普通的PCR體系,；模板,引物,dNTPs，buffer,，Taq酶,；加入各種類型的熒光染料。

在做Real time PCR時,，對于SYBR Green I染料法和Taqman探針法都可以,，但是二者有區(qū)別。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I結(jié)合雙鏈DNA來檢測PCR產(chǎn)物,，可用于監(jiān)測任意雙鏈DNA序列的擴增,，但是必須考慮非特異性擴增。因成本相對低,，是目前較常用的),。但是由于SYBRGreen I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合，包括非特異性的雙鏈DNA序列,，因此可能會產(chǎn)生假陽性信號,。

圖1：SYBR染料法原理圖

Taqman探針法使用熒光探針檢測PCR擴增過程中產(chǎn)生的特異PCR產(chǎn)物：特異性熒光信號的產(chǎn)生，需要探針與目標(biāo)序列進行特異性的雜交,；探針可以標(biāo)記不同的報告基團,，因此可以在一個反應(yīng)管中進行二條序列擴增完整的探針。5′端熒光基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移),；退火,，探針與模板結(jié)合，引物在聚合酶作用下進行延伸反應(yīng),，遇到探針時發(fā)揮3′-5′外切酶活性將探針切碎到反應(yīng)體系中,；報告基團與淬滅基團距離變大，在激發(fā)光的作用下發(fā)熒光,。實驗結(jié)果重復(fù)性好,，價格高。

圖2：TaqMan探針法原理圖

說了這么多,，不知道小伙伴們對qPCR的理解是不是清晰多了呢?qPCR作為一種簡單便捷的定量技術(shù),，應(yīng)該是小伙伴們常用的技術(shù)了。雖然聽起來簡單但做起來卻沒有想象的那么簡單,，事實上,，實驗室做一個樣本檢測QPCR需要1~2個小時，這個時候不僅試劑盒重要,，檢測能力也很重要,，希望這篇文章能幫助小伙伴們對QPCR有一個清晰的了解

如何擺脫qpcr苦惱,，得到更好的結(jié)果

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