mRNA制備解決方案

時間：2021/6/4閱讀：2388

mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后,，基于mRNA開發(fā)新療法更加受到關(guān)注,，包括mRNA傳染病疫苗,、腫瘤免疫療法（癌癥疫苗）,、治療性蛋白質(zhì)替代療法和遺傳疾病治療等,。

基于mRNA技術(shù)的covid-19廣泛使用。目前,，全球范圍內(nèi)已有2種mRNA疫苗獲得FDA的EUA（緊急使用授權(quán)）,，分別是由德國BioNTech、輝瑞和復(fù)星醫(yī)藥共同研發(fā)的BNT162b2（有效率95%）以及美國Moderna公司研發(fā)的mRNA-1273（有效率94.1%）,。

在國內(nèi),，由沃森生物、蘇州艾博生物,、軍事科學院軍事醫(yī)學研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV將于5月30日起在墨西哥開始III期試驗,；斯微生物的mRNA疫苗也進入了I期臨床試驗。

既然mRNA疫苗這么受歡迎,，今天我們就來講講mRNA疫苗是如何體外制備的,。

mRNA疫苗的制備

以covid-19為例，我們首先分離出病毒株,，測序及分析獲得病毒的完整基因序列,，然后通過基因工程技術(shù)，利用化學合成的方式,，合成S刺突蛋白所對應(yīng)的病毒RNA片段,，為了方便接下來的RNA大量復(fù)制，RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下,，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA結(jié)構(gòu),。在基因克隆技術(shù)中，通常將要復(fù)制的DNA嵌入到載體質(zhì)粒中,，利用細菌快速繁殖,，培養(yǎng)，復(fù)制出大量嵌入S蛋白DNA質(zhì)粒的細菌,，經(jīng)過提取,，分離,，純化等工藝，得到大量純凈S蛋白DNA,。S蛋白DNA通過使用轉(zhuǎn)錄試劑完成體外轉(zhuǎn)錄得到大量mRNA,mRNA單獨存在時結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定,，所以在最終制成疫苗時，需要在mRNA外層包裹一層脂類,，最終完成mRNA疫苗的制備,。

mRNA的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化策略

1 mRNA加帽

真核細胞mRNA的5'端有一個帽子結(jié)構(gòu)，它是在mRNA轉(zhuǎn)錄后,，由甲基化的鳥苷酸（m7G）經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連,。5'端帽子結(jié)構(gòu)在mRNA許多生物學功能中起到重要的作用,，這包括：mRNA的剪切,、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和核糖體的募集等,。由于5'端帽子結(jié)構(gòu)的重要生物學功能,，在mRNA疫苗研發(fā)過程中需要優(yōu)化5'端帽子結(jié)構(gòu)，并利用合適的工藝對mRNA原料進行“加帽”,。

mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列”實現(xiàn),，這種加帽技術(shù)會將加帽序列反向加在mRNA上，這會導致約1/3的加帽失敗,。通過摻入特殊的帽子結(jié)構(gòu)——“anti-reverse”帽子結(jié)構(gòu)（ARCA）可以降低這種反向加帽失誤的出現(xiàn),。另外，還可以先合成不帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA,，再利用痘病毒的“加帽復(fù)合物”對mRNA進行加帽,，這也是一種mRNA的加帽手段。

2.非翻譯區(qū)序列（UTRs）修飾

在mRNA的編碼區(qū)兩端各存在一段非翻譯區(qū)（UTRs）,，在5'端的被稱為5'端UTR,，在3'端的被稱為3'端UTR。

非翻譯區(qū)序列不是密碼子,，不能翻譯成氨基酸,，但是可以通過RNA結(jié)合蛋白控制mRNA產(chǎn)品的降解和轉(zhuǎn)錄效率。因此,，每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設(shè)計產(chǎn)品的UTR組件,，進而提高在目的細胞中mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。大量的研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩(wěn)定,，而且能夠增加異源的mRNA的表達效率,，因此這兩個蛋白的UTR原件通常被設(shè)計為mRNA疫苗的UTR組件。當然,，也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件,，在此不再贅述,。

3.Poly（A）

大多數(shù)真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個腺苷酸聚合形成的Poly（A）尾巴。mRNA的Poly（A）尾巴可以和5'端帽子結(jié)構(gòu)共同合作,，增強mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,。Poly（A）尾巴首先和大量的Poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）結(jié)合，然后募集真核生物起始因子4G（eIF4G）,，增加Poly（A）跟5'端帽子結(jié)構(gòu)的親和力,，最終mRNA的Poly（A）尾巴和5'端帽子結(jié)構(gòu)首尾相接，形成環(huán)裝mRNA,。環(huán)裝mRNA結(jié)構(gòu)有利于核糖體的募集,，其特殊的結(jié)構(gòu)也能保護mRNA不被降解。

在mRNA體外合成過程中,，Poly（A）尾巴可以通過質(zhì)粒DNA模板轉(zhuǎn)錄獲得,，也可以先合成mRNA再通過Poly（A）聚合酶加上不同單位數(shù)量的尾巴。前者能夠在mRNA產(chǎn)品中加入特定數(shù)目的Poly（A）,，而后者加入的單位數(shù)不確定,。

Poly（A）尾巴的單位數(shù)目對于其生物學作用起到了至關(guān)重要的作用。在哺乳動物細胞內(nèi),，活躍表達的mRNA包含的Poly（A）序列的長度為100-250個,。有研究發(fā)現(xiàn)，表達效率越高的mRNA,，其Poly（A）尾巴越短,。但是當Poly（A）單位長度小于12時，mRNA結(jié)構(gòu)就不再穩(wěn)定,，容易被降解,。在設(shè)計mRNA疫苗產(chǎn)品的序列時，Poly（A）的長度也是非常重要的優(yōu)化指標,。

4. 開放閱讀框

開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的全部編碼序列,，負責進入人體后表達mRNA運載的抗原靶蛋白。

密碼子水平的修飾,，利用常用的密碼子,，選用tRNA較多的密碼子；使各個密碼子的比例更接近靶物種或者細胞的比例,；

GC含量的修飾,，避免復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)形成；二級結(jié)構(gòu)對mRNA的延伸和轉(zhuǎn)錄非常重要,，高穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)需要避免,。這樣的二級結(jié)構(gòu)可以阻止核糖體的進入、掃描以及容易被先天性免疫識別為PAMP。

mRNA疫苗制備試劑盒：

Cellscript T7 mScript™ Standard mRNA Production System C-MSC11610/C-MSC100625

該試劑盒包含T7 RNA聚合酶,，加帽酶,，加尾酶，以及2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶,，可以一站式解決mRNA制備過程,。

T7-FlashScribe™ Transcription Kit C-ASF3507 以1ug線性化的DNA為模板，在30min內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄可以得到180ug的RNA,。

其他相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	貨號	品牌
T7-FlashScribe™ Transcription Kit	C-ASF3507	cellscript
T7-Scribe™ Standard RNA IVT Kit	C-AS3107	cellscript
ScriptCap™ m7G Capping System	C-SCCE0625	cellscript
ScriptCap™ 2'-O-Methyltransferase Kit	C-SCMT0625	cellscript
ScriptCap™ Cap 1 Capping System	C-SCCS1710	cellscript
A-Plus™ Poly(A) Polymerase Tailing Kit	C-PAP5104H	cellscript

北京和一生物作為Cellscript的國內(nèi)授權(quán)代理,，為你提供CellScript公司全套的mRNA生產(chǎn)的原料，目前產(chǎn)品主要包括體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,，帽類似物,，加帽酶，加尾酶,，以及一些修飾核苷等等,，北京和一生物為你提供全套mRNA制備的解決方案，助力抗擊covid-19,，期待你的咨詢,！

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