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土壤微生物（細(xì)菌,、霉菌）的分離及鑒定
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1) 了解并掌握光學(xué)顯微鏡的操作方法和觀察技巧
2) 學(xué)會(huì)細(xì)菌及真菌觀察鑒定的一系列實(shí)驗(yàn)方法及其原理
二,、實(shí)驗(yàn)器材
1.試劑及藥品：
結(jié)晶紫染液,、 95%乙醇、番紅染液,、 5%孔雀綠水溶液、甘油,、 1 mol/L NaOH 溶液 ,、 1 mol/L
HCl 溶液,、盧戈式碘液、溴甲酚紫指示劑,、甲基紅指示劑,、吲哚試劑,、NaCl、1.6%花生油中
性紅水溶液,、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液,、滅菌水等。
2.器材：
三角瓶,、試管、燒杯,、培養(yǎng)皿,、接種環(huán)、接種針,、載玻片、蓋玻片,、酒精燈,、涂布棒、顯微鏡,、電子天平、藥匙,、玻璃棒,、稱量紙、量筒,、加熱爐,、PH 試紙、高壓蒸汽滅菌鍋,、棉花,、紗布、牛皮紙,、麻繩、恒溫箱,、試管架,、剪刀、鑷子,、解剖刀、U 形管,、移液管等,。
3.樣品：
校園內(nèi)草地深層土壤（深度 20cm）
三、實(shí)驗(yàn)原理
1.細(xì)菌簡(jiǎn)單染色
利用單一染料對(duì)菌體進(jìn)行染色的方法叫做簡(jiǎn)單染色,。
2.細(xì)菌的革蘭氏染色
經(jīng)此法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌,；細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌,。
3.細(xì)菌芽孢染色
首先用著色能力較強(qiáng)的染料,，如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進(jìn)行染色時(shí)，此染料不僅可以進(jìn)入菌體,，而且也可以進(jìn)入芽孢,，進(jìn)入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出,。再用對(duì)比度大的復(fù)染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復(fù)染劑顏色,，而芽孢仍為原來(lái)的顏色，這樣就可以將兩者區(qū)別開(kāi)來(lái),。
4.細(xì)菌的生理生化實(shí)驗(yàn)
糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)
甲基紅試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸,，如甲酸,、乙酸,、乳酸等。
5.真菌的觀察及鑒定
將培養(yǎng)物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)并可連續(xù)觀察不同時(shí)期發(fā)育期的菌體結(jié)構(gòu)特征的變化,。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
4.1 土壤菌群分離
4.1.1 滅菌準(zhǔn)備
配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基,，分別裝入三角瓶中,，封好。將內(nèi)裝 90ml 的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶,、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒,、移液管六支,、試管（內(nèi)裝 9ml 蒸餾水）六支、平皿若干放入滅菌鍋中滅菌,。
4.1.2 梯度稀釋
稱取土壤樣品 10g 加入 90ml 滅菌水中振蕩，直至土壤大顆粒被*打碎,，然后靜置 30 分鐘以上,，使其澄清。實(shí)驗(yàn)時(shí)要保持無(wú)菌操作,，防止雜菌污染土壤菌液,。梯度稀釋是將原液按照十倍的等級(jí)進(jìn)行稀釋,，在無(wú)菌的條件下，用移液管一取 1ml 上清液加入裝有 9ml 滅菌水試管中振蕩,，將其稀釋為 10-1倍,，用不同的移液管依次從已稀釋的菌液中取液，將菌液梯度稀釋為原液的 10-1,、10-2、10-3,、10-410-5
倍,，分別為-1、-2,、-3、-4,、-5 梯度,，分別表示稀釋原液用 0表示,。
4.1.3 涂布平板
將冷卻至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基倒平板，平板固定后進(jìn)行涂布,。在無(wú)菌條件下，用對(duì)應(yīng)編號(hào)的移液管取菌液加到平板中,，然后用涂布棒將其在平板鋪勻,。細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì) 0、 -2,、 -4、 -5 梯度進(jìn)行涂布,，霉菌培養(yǎng)基對(duì) 0,、 -3 梯度進(jìn)行涂布。每梯度涂 3 個(gè)平板,。
4.1.4 恒溫培養(yǎng)
將霉菌培養(yǎng)基放入 27℃恒溫箱中培養(yǎng) 3 天，將細(xì)菌培養(yǎng)基平板置于 37℃恒溫培養(yǎng) 24 小時(shí),。
4.1.5 菌落統(tǒng)計(jì)
對(duì)不同梯度的平板進(jìn)行觀察,，選擇合適梯度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，一般每平板 30 個(gè)為宜,。此次試驗(yàn)中，細(xì)菌培養(yǎng)基上-4 梯度為*佳,。霉菌培養(yǎng)基中-3 梯度為*佳,。在細(xì)菌培養(yǎng)基中，根據(jù)菌落形態(tài)的不同選取 5 種菌,，考慮到可能有的菌相同，本組選取了6 種菌,，對(duì)其進(jìn)行觀察,，描述菌落形態(tài)。選擇三種霉菌,，對(duì)其編號(hào),。
4.1.6 畫線分離
配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基,，滅菌（滅菌鍋：山東興華）后倒取平板，將選出的菌進(jìn)行劃線分離，考慮到菌數(shù)多,，平板不足，每種菌只劃兩個(gè)平板,。劃好后分別放入相應(yīng)恒溫箱中培養(yǎng)。
4.2 細(xì)菌的純化及鑒定
4.2.1 細(xì)菌純化及保藏
配制培養(yǎng)基,，在不同菌劃線的培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落進(jìn)行再次劃線,，直至菌種*純化。
制備試管斜面,，將菌劃斜面培養(yǎng)留種。
4.2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察
對(duì)各菌進(jìn)行制片,，進(jìn)行單染色觀察其形態(tài)
4.2.3 革蘭氏染色
為鑒定細(xì)菌的革蘭氏反應(yīng)對(duì)菌進(jìn)行革蘭氏染色,，染色前先將進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)株為大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）,、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）,，將標(biāo)準(zhǔn)株與純化的八株菌進(jìn)行培養(yǎng) 12-18 小時(shí),，這樣無(wú)芽孢的產(chǎn)生，可以防止其影響染色結(jié)果,。染色完成后進(jìn)行鏡檢,。
4.2.4 穿刺實(shí)驗(yàn)
穿刺實(shí)驗(yàn)是對(duì)菌是否有鞭毛進(jìn)行鑒定的十分有效的方法。
配制細(xì)菌穿刺培養(yǎng)基,，該培養(yǎng)基與細(xì)菌培養(yǎng)基大體相同，將其中的瓊脂減少的原來(lái)的一半
即為半固體穿刺培養(yǎng)基,。
（1）將培養(yǎng)基配好后加熱(微波爐),，使其*融化，略微冷卻后倒入試管中,，密封后滅菌,。
（2）冷卻固定后,，在無(wú)菌（超凈工作臺(tái)：內(nèi)循環(huán)風(fēng)，蘇凈安泰）操作下,，用接種針將各菌穿刺接種到半固體培養(yǎng)基中,，穿刺時(shí)
盡量要直，避免劃壞培養(yǎng)基。
（3）將接種好的穿刺培養(yǎng)基放入 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 24 小時(shí),。
4.2.5 細(xì)菌芽孢染色
1) 制片
按常規(guī)涂片、干燥,、固定,。
2) 染色
加數(shù)滴 5%孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端,，在微火（普通酒精燈）上加熱至染料冒蒸汽并開(kāi)始計(jì)時(shí),。維持 5min,。加熱過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充染液。切勿讓涂片干涸,。
3) 水洗
待玻片冷卻后,，用緩流自來(lái)水沖洗載玻片背面，直至流出的水無(wú)色為止,。
4) 復(fù)染
用 0.5%番紅染液復(fù)染 1.5min 。
5) 水洗
用緩流水洗后,，干燥,。
6) 鏡檢（普通光學(xué)顯微鏡）
先低倍鏡，再高倍鏡,，后油鏡觀察。
4.2.6 生理生化試驗(yàn)
（1）配制培養(yǎng)基
分別配制淀粉培養(yǎng)基,、油脂培養(yǎng)基,，配制好后放入三角瓶中準(zhǔn)備滅菌。配制葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,，裝入試管，將其中的德漢氏小管灌滿放入試管,。配制蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基,，配制好后加入試管中，每支試管 1/3 體積培養(yǎng)基,，準(zhǔn)備滅菌,。
（2）接種準(zhǔn)備
將培養(yǎng)基貼上標(biāo)簽包好后放到高壓蒸汽滅菌鍋中,，在 121℃滅菌 20 分鐘,。滅完菌取出后冷卻，將淀粉培養(yǎng)基,、油脂培養(yǎng)基倒平板,。
（3）接種
①在淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基平板背面用標(biāo)簽筆畫一個(gè)十字,，將其分為相等的四個(gè)區(qū)域，再在相應(yīng)的位置寫上要種的菌種的編號(hào),，在無(wú)菌條件下，將菌種分別接在相應(yīng)的區(qū)域,，對(duì)于淀粉培養(yǎng)基,，在接種時(shí),，采取觸點(diǎn)接種，對(duì)于脂肪培養(yǎng)基,，采取畫十字接種,貼上標(biāo)簽,。
②在無(wú)菌條件下，將各菌種分別接在糖發(fā)酵培養(yǎng)基液中,，每種菌在葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基中各接兩支培養(yǎng)基,，每種留一支作為對(duì)照,，貼上標(biāo)簽。
③在無(wú)菌條件下,，將各菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,，每種菌分別在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中接兩支培養(yǎng)基試管，貼上標(biāo)簽,。
（4）培養(yǎng)
將接種好的培養(yǎng)基放到 37 攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng) 48 小時(shí),。
（5）實(shí)驗(yàn)觀察
4.2.7 確定菌屬
在根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,，查詢伯杰氏手冊(cè)，確定菌的屬,。
4.3 霉菌的純化及鑒定
4.3.1 霉菌純化
配制 PDA 培養(yǎng)基,，將霉菌再次劃線，直至菌種*純化,。
4.3.2 霉菌形態(tài)觀察
（1）營(yíng)養(yǎng)小室及其他滅菌準(zhǔn)備
（2）制備營(yíng)養(yǎng)小室
（3）接種
（4）放置 27℃恒溫箱中培養(yǎng)三天
（5）培養(yǎng)三天后，將營(yíng)養(yǎng)小室從恒溫箱中取出，用顯微鏡觀察霉菌形態(tài),。
4.3.4 霉菌鑒定
根據(jù)觀察結(jié)果,，查詢相應(yīng)的霉菌圖譜，確定分離出的霉菌的類別,。