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質(zhì)粒DNA提取、純化和鑒定
一,、實驗原理
細胞破碎后,，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但兩者變性與復性所依賴的溶液pH值不同,。在pH值高達12.0的堿性溶液中,，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性,；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂,，但兩條互補鏈不*分離。當用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時,，變性的質(zhì)粒DNA可恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中,；但染色體DNA不能復性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA,、蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起形成纏連的,、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心,，與復性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離,。溶于上清的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液,，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時,，也伴隨著RNA沉淀,，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,，可通過酚/氯fang抽提除去,，后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。
簡言之：在細胞破碎后,，染色體DNA和質(zhì)粒DNA 釋放到溶液中,，當PH為12時，DNA的氫鍵斷開,，由于質(zhì)粒DNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu),，所以兩條鏈沒有分離，而染色體DNA兩條鏈*分開,，氫鍵斷開而分離,。當PH值恢復到中性時，質(zhì)粒DNA恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中-------------除去染色體DNA,、大分子RNA和蛋白質(zhì)-SDS復合物纏連成白色絮狀沉淀,，離心分離。
加入乙醇后,，上清質(zhì)粒DNA凝聚成沉淀,，會有RNA存在，加入RNA酶,，使RNA降解,。---------------去除RNA分子。
二,、實驗儀器
微量取液器（20,、200、1000微升）,、臺式高速離心機,、恒溫震蕩搖床、高速蒸汽消毒器（滅菌鍋）,、渦旋震蕩器,、電泳儀、瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等,。
三,、實驗步驟
堿變性法提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質(zhì)粒；收集和裂解細胞,；分離和純化質(zhì)粒DNA。
①細菌的培養(yǎng)和收集
將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期,。 (培養(yǎng)箱,、搖床)
②質(zhì)粒DNA少量快速提取
1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒,。（移液器,、離心機）
2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡,。
3,、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。（移液器）
4,、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口,，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。（移液器）
5,、加入150μl預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口,，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘,。 （移液器,、離心機）
6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯fang(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘,。
7,、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘,。 （冰箱,、離心機）
8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘,。
9,、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。
10,、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0,，含20μg /ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中,。
* 溶液一：重懸菌體,，提供緩沖環(huán)境。
溶液二：氫氧化鈉和SDS裂解菌體細胞壁,、在細胞膜上穿孔,，釋放細胞內(nèi)的質(zhì)粒。
溶液三：中和氫氧化鈉,、SDS中的鈉被鉀替換,，吸附菌體產(chǎn)生沉淀,。
③DNA鑒定
實驗儀器
恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機,，旋渦振蕩器,，水浴鍋，1.5mL離心管,，50mL離心管,，不同型號的吸頭，微量移液器,，微波爐,，電泳儀，制膠槽,，電泳槽,，梳子，錐形瓶,，電子天平,，手套，紫外燈,，Eppendorf管等,。
DNA純度檢測
（1） 取40mLTAE（1×）于300mL錐形瓶中，加入0.4g瓊脂糖,，放入微 波爐內(nèi)使其熔化,，60℃時倒入準備好的制膠槽中。（微波爐,、制膠槽,、梳子）
（2） 取5.0μl純化DNA加入1.0μl上樣緩沖液，混合,，進行點樣,。（移液器、電泳儀）
（3） 點樣完畢后,，100V,，200mA條件下電泳30min。
（4） 電泳完畢后,，進行EB染色,，用凝膠成像儀拍照，得到實驗結(jié)果,。（凝膠成像系統(tǒng)）