一、染色步驟

1. ?樣本固定?

• 成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后,，吸去培養(yǎng)基,，用1×PBS輕柔洗滌細(xì)胞2~3次?23。

• 加入4%多聚甲醛或10%福爾馬林固定液,，室溫固定30分鐘?12,。

2. ?洗滌與風(fēng)干?

• 去除固定液后，用蒸餾水或1×PBS沖洗3次以去除殘留固定劑?12,。

• 風(fēng)干載玻片或培養(yǎng)板,，確保樣本干燥?34。

3. ?染色處理?

• 加入0.1%茜素紅染色液（溶于0.05M Tris-HCL緩沖液,，pH8.3）,，37℃孵育5-30分鐘（時(shí)間依鈣鹽含量調(diào)整）?12。

• 染色后迅速用蒸餾水沖洗,，避免染料殘留導(dǎo)致背景過(guò)深?23,。

4. ?復(fù)染與觀察?

• 可選固綠染色液復(fù)染1分鐘以增強(qiáng)背景對(duì)比度?34。

• 顯微鏡下觀察：鈣結(jié)節(jié)呈橙紅色,，背景為綠色或粉紅色?23,。

5. ?保存?

• 染色后樣本用封口膜密封，4℃保存可維持染色效果2周?23,。

二,、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. ?操作輕柔?

• 避免劇烈震蕩或長(zhǎng)時(shí)間暴露于液體中,，防止鈣結(jié)節(jié)脫落?12。

2. ?染色條件優(yōu)化?

• 染色液使用前需恢復(fù)至室溫,，染色時(shí)間根據(jù)鏡下鈣鹽沉積量動(dòng)態(tài)調(diào)整（通常5-10分鐘）?23,。

• 染色過(guò)深時(shí)可用1%鹽酸酒精分色?4。

3. ?試劑選擇?

• 推薦使用商品化茜素紅S試劑（如Beyotime ST1078-5g）,，純度穩(wěn)定?5,。

• 固定劑優(yōu)先選擇中性福爾馬林，避免酸性條件干擾鈣鹽結(jié)構(gòu)?24,。