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泛素化實驗

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更新時間：2025-02-28 15:27:56瀏覽次數(shù)：128次

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?E3連接酶篩選與驗證?

通過酵母雙雜交、GST Pull-down或CRISPR篩選技術發(fā)現(xiàn)候選E3酶，再通過體外/體內(nèi)泛素化實驗驗證其功能?17,。
示例：研究KRAS突變時,，發(fā)現(xiàn)USP25與RNF31調(diào)控KRAS的線性泛素化修飾?1。
?泛素鏈類型分析?

利用特異性泛素抗體（如K48,、K63鏈抗體）或串聯(lián)泛素結合結構域（TUBEs）區(qū)分泛素鏈連接方式?36,。

  • ?體外泛素化實驗?

    • 使用重組表達的E1、E2,、E3酶與底物蛋白,，結合ATP、泛素分子進行反應,，通過Western Blot檢測底物泛素化水平?26,。

    • 常用試劑盒（如Ubiquitinylation Kit）可標準化操作流程?7。

  • ?體內(nèi)泛素化檢測?

    • 在細胞中過表達泛素,、E3連接酶及底物蛋白,，利用蛋白酶體抑制劑（如MG132）阻斷降解，通過免疫共沉淀（Co-IP）富集目標蛋白后檢測泛素化信號?26,。

  • ?泛素化位點鑒定?

    • ?質(zhì)譜法?

      ：通過富集泛素化肽段,，結合高分辨率質(zhì)譜確定具體修飾位點?45。

    • ?點突變驗證?

      ：基于生物信息學預測（如UbiNet,、GPS-Uber等工具）,，對潛在賴氨酸位點進行突變后觀察泛素化水平變化?47。


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