一,、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

材料與試劑

• ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?：6-12周齡C57BL/6小鼠(推薦雌性)68

• ?基礎(chǔ)培養(yǎng)基?：RPMI-1640(含10%FBS、2mM L-谷氨酰an,、1%雙抗)38

• ?關(guān)鍵細(xì)胞因子?：

• GM-CSF(20ng/ml)68

• IL-4(10ng/ml,，用于外周血DC培養(yǎng))5

• ?其他試劑?：

• 紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl)3

• 0.125%蛋白酶(用于組織消化)4

• Percoll分離液(用于外周血DC分離)5

二、骨髓來源DC(BMDC)培養(yǎng)流程36

1. 骨髓細(xì)胞獲取

• 頸椎脫臼法處死小鼠,，75%酒精浸泡消毒5分鐘38

• 無菌條件下取出股骨和脛骨3

• 用1ml注射器沖洗骨髓腔至培養(yǎng)基變渾濁3

• 1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞3

2. 紅細(xì)胞裂解

• 加入2ml Tris-NH4Cl裂解液,，靜置1分鐘

• 加入15ml培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心棄上清

3. 細(xì)胞培養(yǎng)

• 按5×10?/ml密度接種于未TC處理的培養(yǎng)瓶

• 添加GM-CSF(20ng/ml)和β-巰基乙醇(50μM)

• 37℃,、5%CO?培養(yǎng),，每2-3天半量換液

三、外周血DC培養(yǎng)流程

1. 單個(gè)核細(xì)胞分離

• 肝素抗凝血經(jīng)Ficoll密度梯度離心

• 收集單個(gè)核細(xì)胞層,，PBS洗滌2-3次

2. 貼壁篩選

• 37℃貼壁3小時(shí),，去除懸浮細(xì)胞

• 繼續(xù)培養(yǎng)過夜(12-18小時(shí))

3. DC富集

• E花環(huán)形成法結(jié)合Percoll離心

• 抗人IgG親和吸附(Panning)進(jìn)一步純化

四、培養(yǎng)觀察與鑒定

形態(tài)特征

• 初期：圓形或橢圓形

• 成熟期：典型樹突狀突起

表型鑒定(流式檢測)8

• 標(biāo)志物：CD11c,、MHC-II,、CD80、CD86,、CD40

• 純度要求：CD11c陽性率>90%

五,、注意事項(xiàng)

1. ?無菌操作?：全程超凈臺(tái)內(nèi)完成

2. ?細(xì)胞因子濃度?：GM-CSF濃度影響DC產(chǎn)量

3. ?成熟誘導(dǎo)?：可添加LPS或TNF-α促進(jìn)成熟

4. ?功能檢測?：混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)驗(yàn)證抗原提呈能力

5. ?應(yīng)用時(shí)機(jī)?：培養(yǎng)7-10天為最佳使用期