細(xì)胞鈣離子檢測實驗原理：

Fluo-3廣泛用于長波長的熒光鈣指示劑,。其在506 nm處被吸收,可以被氬離子激光的488 nm激發(fā)光激發(fā),便于檢測,。Fluo-3在沒有 同鈣結(jié)合的情況下,無熒光產(chǎn)生。但是,在與鈣結(jié)合后,熒光( 526 nm )增強至少40倍,。Fluo-3/AM是一 種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料,。 Fluo-3/AM的熒光非常弱 ,其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3/AM進(jìn) 入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3 ,從而被滯留在細(xì)胞內(nèi),。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合,結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光,大激發(fā)波長為506 nm ,大發(fā)射波長為526nm,。實際檢測時*使用的激發(fā)波長為488 nm左右,發(fā)射波長為525-530 nm。
細(xì)胞鈣離子檢測實驗步驟：
1)用激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,。去除培養(yǎng)基后,用PBS洗滌細(xì)胞,然后加入適量含有fluo-3/AM的PBS緩沖液( fluo-3/AM終濃度為0.5-5μM ),置于37°C避光孵育 30分鐘,。探針濃度和負(fù)載時間需要根據(jù)細(xì)胞類型進(jìn)行調(diào)整,可查閱文獻(xiàn)。
2)用PBS溶液輕洗2次,再加入PBS緩沖液,，繼續(xù)孵育20 min , 37°C ,確保fluo-3/AM在胞內(nèi)*水解成fuo-3,。
3)用LCSM采集熒光信號, 激發(fā)波長488 nm ,發(fā)射波長525 nm。
注意:此處理方法適用于貼壁細(xì)胞,。如果是懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞,可低速離心收集細(xì)胞后,進(jìn)行處理,，
然后取細(xì)胞懸液滴在共聚焦蓋玻片上直接觀察,。