實(shí)驗(yàn)原理

干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)(sphere-formation assay)是一種基于非貼壁依賴培養(yǎng)條件的干細(xì)胞篩選技術(shù)
,。在無(wú)血清但富含特定細(xì)胞因子的培養(yǎng)環(huán)境中，具有干性的細(xì)胞能夠聚集成團(tuán)形成三維球體結(jié)構(gòu),，而普通分化細(xì)胞則因缺乏貼壁條件而凋亡
,。這種球體結(jié)構(gòu)能模擬體內(nèi)干細(xì)胞微環(huán)境，是評(píng)估細(xì)胞自我更新能力的金標(biāo)準(zhǔn),。

實(shí)驗(yàn)材料

• ?細(xì)胞樣本?：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期干細(xì)胞(推薦60-80%融合度)
  

• ?特殊耗材?：

• 超低吸附培養(yǎng)板(6/12/24孔)
  

• 細(xì)胞篩(70μm孔徑)
  

• ?培養(yǎng)基組分?：

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12或1640)
  

• B27營(yíng)養(yǎng)液(50X)
  

• 重組生長(zhǎng)因子(EGF 10ng/mL, bFGF 10ng/mL)
  

• 胰島素(5μg/mL)
  

實(shí)驗(yàn)步驟

一次成球培養(yǎng)

1. 消化收集細(xì)胞,，PBS清洗2次去除血清
   

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1000個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于超低吸附6孔板
   

3. 加入無(wú)血清成球培養(yǎng)基(含EGF+bFGF)
   

4. 37℃,、5% CO?培養(yǎng)7-10天
   

二次成球驗(yàn)證

1. 70μm細(xì)胞篩過(guò)濾收集原代球體
   

2. 消化成單細(xì)胞懸液,，PBS重懸
   

3. 按相同條件進(jìn)行二次培養(yǎng)
   

4. 計(jì)算球體形成效率(SFE)=球體數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%
   

關(guān)鍵參數(shù)

• ?接種密度?：500-2000個(gè)細(xì)胞/孔(密度過(guò)高易導(dǎo)致球體融合)
  

• ?培養(yǎng)周期?：7-14天(定期鏡下觀察球體形態(tài))
  

• ?鑒定標(biāo)準(zhǔn)?：

• 直徑>50μm的球體計(jì)為有效克隆
  

• 連續(xù)傳代3次仍保持成球能力
  

應(yīng)用領(lǐng)域

• ?腫瘤干細(xì)胞研究?：富集CD44+/CD133+腫瘤起始細(xì)胞
  

• ?藥物篩選?：評(píng)估靶向干細(xì)胞藥物的效果
  

• ?衰老研究?：檢測(cè)脂肪祖細(xì)胞(APCs)的年齡相關(guān)活化

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