1. SD大鼠,，250g，通過頸椎脫位處死大鼠,，浸入75%乙醇浸泡5分鐘，轉移到通風柜中的解剖盤中,。

2. 打開皮膚,，暴露、收集股骨,，無菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織,。

3. 并轉移股骨至預冷含雙抗的PBS中，洗滌三次,。冰上操作,。

4. 切斷股骨骨骺， 使用5mlPBS,，1ml注射器針頭沖洗,，沖洗液由棕色變成粉紅色即可（股骨變白）。沖洗后,，用1ml注射器吹打3-5次,。

5. 70um濾網(wǎng)過濾，棄去篩網(wǎng),。使用 15ml 離心管,，先加入分離液，然后緩慢加入濾過的懸液,。20℃環(huán)境下,，600g 離心 25min。

6. 離心后,，離心管中液體由上至下分為四層,。第一層為稀釋液層,。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層,。第四層為紅細胞層,。

7. 小心吸取離心管中的，環(huán)狀乳白色單個核細胞層,，轉移到新離心管中,，加入 5-10ml 洗滌液，混勻細胞,。400g,，離心 10min。

8. 棄去上清,，用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細胞,。 250g，離心 10min,，棄去上清,。 再用M199培養(yǎng)基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF,，1 ng/mL EGF,，20%胎牛血清、1%雙抗）清洗一次,，棄去上清,，M199培養(yǎng)基重懸細胞。250g,，離心 10min,，棄去上清。M199培養(yǎng)基重懸細胞,，計數(shù),。

9. 按3×10⁶/孔種入纖連蛋白包被過的24孔板，每3天換一次培養(yǎng)基,，以去除非貼壁細胞,，持續(xù)誘導培養(yǎng)2-3周。