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  瓊脂具有特殊的溶點和凝固點,，所含成分很難被微生物分解利用且不含抑制性成分，因此很適用于微生物培養(yǎng)基的制備,，從而作為固體培養(yǎng)基最chang用的凝固劑,，到目前為止，在這方面世界上還沒有一種能夠替代瓊脂的代用品,。

  一些初期從事植物組織培養(yǎng)工作或微生物培養(yǎng)的人員,，尤其是初學(xué)者，在配制培養(yǎng)基時往往會遇到培養(yǎng)基難以正常凝固的現(xiàn)象：或呈半流體,、或wanquan呈液體狀態(tài),、同時還會現(xiàn)出各種顏色。本文將對瓊脂的凝固性以及影響其凝固性的關(guān)鍵因素作系統(tǒng)的介紹,，并針對不同的操作方法進(jìn)行問答式評價,，以期能幫助更多的人解決實際工作中的相關(guān)問題，少走彎路,。

一,、有關(guān)瓊脂的知識

  瓊脂，又名瓊膠或凍粉,，因最初從日本海藻中提取,，故又稱“洋菜"。瓊脂成品為白色或淡黃色粉末狀或細(xì)條形,，主要是由復(fù)雜的大分子多糖類物質(zhì)組成,。其水解物的組成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸,，實際上,，它是瓊脂膠和瓊脂糖兩種成分的混合物。瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯,，瓊脂糖主要依靠氫鍵的引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),。因此，瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性比那些以化學(xué)鍵交聯(lián)而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝固劑的穩(wěn)定性要差一些,。

  瓊脂溶于熱水而不溶于冷水,，因此在配制培養(yǎng)基時需煮制瓊脂。隨著溫度的升高,，瓊脂逐漸溶解,，當(dāng)溫度下降到40℃時則開始凝固。配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意，由于各地生產(chǎn)的瓊脂的質(zhì)量不同,，同樣濃度的瓊脂水溶液凝固后在硬度,、透明度及色澤上會有所差異。劣質(zhì)瓊脂不僅凝固性差,，而且?guī)в泻芏嚯s質(zhì),。

二、有關(guān)瓊脂凝固性的知識

  作為培養(yǎng)基的凝固劑,，瓊脂的凝固性除與瓊脂本身的品質(zhì)有關(guān)外,，還會受到滅菌溫度、滅菌時間,、瓊脂量和pH值的影響,。

  （1）0.7%～0.8%的瓊脂水溶液在冷卻后會很好凝固，對于常用的微生物培養(yǎng)基,，瓊脂的用量基本趨于穩(wěn)定,，通常條狀瓊脂的用量約為2%，粉狀瓊脂的用量為1%～1.5%,。

  （2）培養(yǎng)基的酸堿度對瓊脂的凝固性影響很大，是瓊脂在正常濃度范圍內(nèi)能否凝固的關(guān)鍵因素,，當(dāng)4.30<ph<10.05時,，瓊脂水溶液均可正常凝固，超過此范圍,，瓊脂的凝固性變差,，培養(yǎng)基不能正常凝固。< span="">

  （3）在4.30<ph<10.05范圍內(nèi),，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1 kg="" cm<="" span="">²,，120℃)的影響很小，延長高溫高壓滅菌時間或反復(fù)高溫高壓處理均不會影響其凝固性,。pH較高(5.0-8.0)時,，瓊脂濃度是影響凝固等級的主要因素。

<ph<10.05范圍內(nèi),，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1kg cm

  （4）當(dāng)配制的固體培養(yǎng)基pH低于3.44時,，其凝固性會受到滅菌溫度、滅菌時間,、瓊脂量和pH值的影響,。其中滅菌溫度、滅菌時間與瓊脂凝固性呈負(fù)相關(guān),，瓊脂量,、pH值與瓊脂凝固性呈正相關(guān)。但在這些因素中，瓊脂量的影響不是很大,，因此在該類培養(yǎng)基的滅菌過程中應(yīng)該重點把握好滅菌溫度,、滅菌時間和pH值。使用較低的滅菌溫度,，較短的滅菌時間,，適當(dāng)?shù)卦黾优囵B(yǎng)基的pH值就可以顯著提高瓊脂的凝固性。pH較低(≤4.0)時,，pH是影響凝固等級的主要因素,。

三、案例分析

  基于實驗得出的理論知識,，大家都比較好理解和接受,，但在實際操作過程中，經(jīng)常會有人碰到瓊脂不能凝固的情況（如圖1）,，下面針對具體案例進(jìn)行分析討論：

圖1 滅菌后的培養(yǎng)基出現(xiàn)分層現(xiàn)象

案例一

  問：我使用的是**生產(chǎn)的瓊脂,，用冷水就能溶解了，高壓蒸汽滅菌后就能使用了,，最近在倒平板時,，發(fā)現(xiàn)有幾塊怎么也不凝固，同一瓶子里的瓊脂只有幾塊不凝固,，我專門放到第2天發(fā)現(xiàn)還是稀呼呼的,。

  答：首先糾正一下，您說用冷水就能溶解了,，這肯定不對：瓊脂溶于熱水而不溶于冷水,，將瓊脂放在冷水中，充其量只能是把瓊脂浸濕了泡軟了,，根本達(dá)不到溶解的程度,，也就談不上均勻地分散在培養(yǎng)基溶液中了。既然分散不均勻,，滅菌后倒出的平板,，就容易產(chǎn)生瓊脂含量不一的結(jié)果，表現(xiàn)出來的現(xiàn)象就是您所描述的,，同一瓶子里的瓊脂,，有幾塊怎么也不凝固，即使放到第2天或更多天,，也不會凝固,，因為里面的瓊脂含量很少啊，達(dá)不到凝固的要求,，即使放再多時間結(jié)果也是一樣,。

  問：必須要wanquan煮化嗎？

  答：瓊脂必須煮沸，常溫下是溶解不了的,，只有煮沸后再冷卻才會凝固,。

  問：夏天溫度高的時候是不是就不用煮沸了？

  答：配好培養(yǎng)基后,，一定要加熱攪拌溶解,。培養(yǎng)基外包裝標(biāo)簽上說得很清楚，要加熱煮沸至wanquan溶解,，夏天溫度再高也不會超過50度吧,？所以天氣熱了也要這么做，使得培養(yǎng)基中各成分混合均勻,。步驟不要省略?。?！

  問：那我們以前都是同樣的操作,，怎么都好著呢？

  答：正確的培養(yǎng)基配制方法應(yīng)該是先將含瓊脂培養(yǎng)基煮沸至wanquan溶解之后,，再分裝入三角瓶中進(jìn)行滅菌,，并且滅菌完畢從鍋里拿出來后，要及時搖一搖三角瓶（用力搖）,，使滅菌后的培養(yǎng)基中瓊脂能夠均勻分散在里面,，然后再傾倒平皿。你之前沒出問題,，不代表你的操作就是合乎要求的，你不按照正規(guī)的方法操作,，遲早會出問題的,，這不就被你碰到了嗎？

  另外,，即使滅菌前沒有先煮沸再分裝滅菌,，只在滅菌完畢，開鍋后第一時間將瓶內(nèi)培養(yǎng)基搖勻,，也就不會出現(xiàn)你碰到的問題了,。

  這里需要注意，搖勻,，一定是用力搖勻,，而不是隨手輕輕一晃就行了。

  問：為何還要搖??？你在煮沸、滅菌時，不就自然勻了嗎,？

  答：滅菌時能自然勻了,？這也是你自己認(rèn)為的吧？當(dāng)然很多人都會這么認(rèn)為,。熬粥的時候滿鍋里都沸騰,，稍放置一會兒，鍋底的粥是不是要稠一些,？大同小異,！

  問：可是滅菌后搖晃容易產(chǎn)生氣泡啊,？

  答：開鍋拿出來后手搖幾下就勻了,，少量氣泡稍微靜置就會消掉的，或者放到水浴鍋里恒溫到50度的時候一般就沒有氣泡了,。臨倒平板前就不要搖了,！那時候再搖，氣泡可能就不容易消掉了,。

  問：那我怎么搖勻,？我用500mL的三角瓶配500mL培養(yǎng)基，根本搖不起來,！

  答：問題就出來這里,，做微生物實驗，將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)容器中,，培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過容器容積的2/3(可參考GB 4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求),。也就是說不要將瓶子里裝得滿滿當(dāng)當(dāng)?shù)模@樣很容易導(dǎo)致瓊脂沉在下面,，不容易搖勻,。

  我們平時做實驗，配500mL培養(yǎng)基用1000mL的瓶子,，配200mL培養(yǎng)基用500mL瓶子,，500mL的瓶子里最多裝400mL培養(yǎng)基的，你比較看看你的裝量,。

  問：我們一直都這么配制的,，只是最近的出了問題，同一瓶培養(yǎng)基,，只有幾個板這樣的,。

  答：培養(yǎng)基的標(biāo)簽上有明確的用法：稱23.5 g于1 L蒸餾水中，加熱煮沸wanquan溶解,，121攝氏度滅菌15分鐘,，冷卻至46攝氏度左右備用,。

  對比上面的解答，看看你們一直以來的操作有哪些問題吧,，然后按照正規(guī)的操作要求再堅持一段時間,，再出現(xiàn)同樣的問題再來找我好吧？(不搖勻的情況下,，同一瓶培養(yǎng)基倒出的平板強(qiáng)度差異很大,，可參考附錄表格)。

案例二

  問：配制的是營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，都是按照上面說的配制的,，滅菌后放入冰箱怎么也不能wanquan凝固，在底部還有非常硬的像膠皮一樣的胨,。請幫忙看看到底是怎么回事,。

  答：有沒有想過最底部的非常硬的膠皮一樣的東西是什么？那就是相對很濃的瓊脂液冷卻形成的,。如果把這一部分瓊脂趁熱搖勻,，使其均勻分散在整瓶培養(yǎng)基里面呢？是不是上面就沒那么稀了,，能凝固了,，下面也沒那么稠了，硬度合適了,。也就是說搖勻后倒平皿,，整瓶培養(yǎng)基都能用了。

  你滅菌后沒經(jīng)過搖勻,，瓊脂本來就沉積在瓶底,，直接放入冰箱，瓶底迅速冷卻,，大量的瓊脂就先凝固了,，瓶子上面的部分含瓊脂就很少了，所以才會不凝固,。不管放多久都不會改善??！

  問：聽說瓊脂太酸也不會凝固,，是不是我們使用的培養(yǎng)基pH不合格啊,？

  答：pH合格不合格,，你測一下不就知道了。在pH 5-10之間,，pH對瓊脂的凝固性影響并沒有那么大,。你用的都是常規(guī)培養(yǎng)基,，pH怎么可能那么低嘛。另外,，如果是pH值太低的話,，加熱以后瓊脂會變性，底部就不會有凝固的瓊脂硬塊了,，而會成一瓶糊糊,。你這顯然是瓊脂混合不均勻引起的，使用前用微波溶化,，晃一晃就好了,。

  問：用兩個大燒杯把融化了的培養(yǎng)基來回傾倒混勻，然后倒皿,，效果不錯,。

  答：道理是一樣的，就是為了使瓊脂混合均勻,。但這種操作方法有點繁瑣,，并且容易染菌，不提倡,。

  問：像我這種情況,，培養(yǎng)基還能用嗎？

  答：能用,！重新水浴加熱,，讓其wanquan溶解后，搖勻,，傾倒平板即可,。或者用微波加熱,，要注意隨時觀察,，經(jīng)常拿出來搖一搖，以免培養(yǎng)基噴出,。

  問：培養(yǎng)基可以多次這樣反復(fù)融化使用嗎,？

  答：不建議！如果不是不得已,，建議現(xiàn)滅現(xiàn)用,。

案例三

  問：今天分別用了伊紅美藍(lán)瓊脂和營養(yǎng)瓊脂兩種培養(yǎng)基做斜面，然而滅菌后做斜面都不凝固,，這是為啥,？有的凝固也就是一半凝。

  我的步驟：如營養(yǎng)瓊脂,，按配比稱3.3g加100mL水,，加熱攪拌溶解,，分裝到試管中后加棉花塞，包扎后于121℃滅菌鍋中滅菌20分鐘,，好了之后制作斜面,，等了有半小時久，培養(yǎng)基都不凝固這是為何,？

  答：你先要煮沸溶解培養(yǎng)基,，攪拌均勻，稍冷后（50℃）盡快分裝,，瓊脂的在水中需加熱至95℃時才開始熔化,，你只是加熱攪拌溶解，瓊脂是不是真正溶解透了有待考證,。

  試管滅菌完畢,，拿出來晃一晃再擺斜面，否則容易上層稀不凝固,，下層濃很容易凝固,。跟三角瓶滅培養(yǎng)基是一樣的道理。

  問：我煮了還是沒很凝固這是為什么,？

  答：先加熱煮沸,，直至白色泡沫上升，然后再分裝,、高溫高壓滅菌,。

  問：白色泡沫上升好危險，我試過被瓊脂沸騰連塞子噴我一臉,！

  答：我們通常都是用搪瓷缸,，最多裝液量1/3，煮沸三次,，徹di煮透,、溶透。

  問：溶解后用吸量管分裝,，在吸量管中就凝固了,，要怎么分裝？量筒嗎,？

  答：我們都是用10 mL或5 mL移液槍分裝的,，再把分裝試管塞好滅菌。

  煮沸溶解分裝然后滅菌制斜面成功了,！再次提醒,，滅菌后,，溫度沒降下來前一定要搖一搖,，不管瓶裝還是試管裝,，都要搖勻！,！

案例四

  問：瓊脂培養(yǎng)基制作斜面為什么無法wanquan凝固,，而做培養(yǎng)皿時wanquan凝固？

  答：瓊脂混合不均勻,。相比三角瓶,，試管的空間更加狹小，開鍋后一定要趁熱晃一晃,，使底部沉積的瓊脂wanquan混勻,。否則就容易導(dǎo)致試管底部凝固，而上部不凝固或凝固不好的問題,。

案例五

  問：微生物檢驗用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,，可以第二次高壓滅菌么?有何影響，如果加熱培養(yǎng)基使其溶化后,，不一會兒就會凝,，而如果用高壓滅菌就不會很快凝固，所以想再用高壓濕熱滅菌,，加熱使其溶化,，可否?

  答：二次高壓濕熱滅菌，會導(dǎo)致營養(yǎng)成分的損失,。所以,，最好是通過水浴加熱，溫度維持在100度,，瓊脂就可wanquan化開,，冷卻至50度左右，就可進(jìn)行倒板等操作了,。

  問：培養(yǎng)基能加熱幾次?營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉配置好了以后,，我是保藏在冰箱里的，同一瓶最多能水浴幾次使用呢?

  答：在保證不染菌的情況下是可以多次使用的,。瓊脂的溶解溫度是95度,，若水浴的話時間來得及可以是沸水浴。若是時間緊迫可直接放在電爐上熔化,，但要一直盯著,，防止沸出來。如果是已經(jīng)滅好菌的玻璃器皿,，可以用微波爐加熱,，不過要注意觀察，防止沸騰出來,。一般從冰箱里拿出來就用一次,，不提倡反復(fù)融化,。

  問：有人說加熱時間過長，也會導(dǎo)致瓊脂不凝固,，是這樣嗎,？

  答：是的。通常來說,，滅完菌就要及時開鍋取出培養(yǎng)基,。如果因為其他原因，耽誤了,，稍有延長也不大要緊,，這里所說的加熱時間過長，是指高壓超過半小時或者滅菌后一直放在滅菌鍋內(nèi)很長時間甚至過夜的情況,。這些都是錯誤的操作,，即使培養(yǎng)基能凝固，里面的營養(yǎng)成分也發(fā)生了很大的變化,，對實驗結(jié)果的判斷造成很大影響,。應(yīng)該杜絕類似的操作。

  通過上述幾個案例的分析,，我們可以總結(jié)一下,。遇到固體培養(yǎng)基不凝固的情況，通常首先考慮一下幾點：

  （1）瓊脂少,，特別是自己配制培養(yǎng)基時,，可能根本就漏加瓊脂了；

  （2）pH值不對,，實驗室用水PH過低,，且配制完沒能調(diào)整pH，或者本身就是酸度很大的培養(yǎng)基,；

  （3）反復(fù)加熱,；

  （4）加熱時間過長；

  （5）滅菌前是否煮沸溶透,，滅菌后是否搖勻,。

  結(jié)合自己的實際操作，一項一項排除查找原因,。這里面,，zui簡單也最容易被忽視的就是滅菌后搖勻的問題。

  本實驗室試驗對比發(fā)現(xiàn),，傾倒平皿前搖勻與不搖勻,，所形成的平板強(qiáng)度差異很大，如果不經(jīng)搖勻直接傾倒，形成的平板有約有2/3凝膠強(qiáng)度過低,，不能滿足試驗要求,，而最后倒出的幾塊平板強(qiáng)度會急劇升高，硬度過大,，也影響使用；而搖勻后再傾注的平板,，凝膠強(qiáng)度數(shù)值分布比較均勻,，滿足試驗要求（表1，圖2）,。經(jīng)常聽到有人說,，平常一直那么做（不煮沸，不搖勻）,，都沒問題,，實際上那樣倒出來的平板只是都凝固了而已，即使能用,，平板間凝膠強(qiáng)度的差異也是很大的,。

  希望大家在實際操作中一定注意，嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作,。

附圖表：

表1 用相同方法配制的等量培養(yǎng)基開鍋后搖勻與不搖勻傾倒成的平板強(qiáng)度

圖2 傾倒平板前培養(yǎng)基搖勻和不搖勻所傾注的平板強(qiáng)度規(guī)律

注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載,。