瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì)樹脂填料 Smartaroe 蛋白純化

Smartarose是一種球形瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì),，Smartarose 4B和Smartarose 6B的瓊脂糖含量分別為4%和6%o Smartarose CL凝膠是 Smartarose 4B和Smartarose 6B的衍生物,，化學(xué)和物理性能更優(yōu)異，流速更快,。Smartarose CL凝膠耐有機(jī)溶劑,，因此適合在有機(jī)溶劑 中分離物質(zhì)。Smartarose和Smartarose CL分離范圍較廣,，適合對分子量不同的樣品進(jìn)行表征或分離,。

瓊脂糖凝膠過濾基質(zhì)樹脂填料 Smartaroe 蛋白純化性能

   pH范圍是我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)估算的,。請注意：pH長期穩(wěn)定性是指凝膠在長時間內(nèi)其層析性能不會改變的pH范圍,。pH短期穩(wěn)定性是指凝膠再生和清洗時穩(wěn)定的pH范圍。

裝柱說明：

介質(zhì)保存于20%乙醇,。裝柱前建議將20%乙醇抽濾去除,，置換成去離子水。

將75%介質(zhì)和25%去離子水混句,，真空負(fù)壓脫氣,。不要使用粘性試劑裝柱。裝柱完成后,，可以用粘性緩沖液低流速平衡層析柱,。

2.2介質(zhì)裝填

裝柱方法有兩步，第二步應(yīng)在恒壓下進(jìn)行,，柱壓見表2,。凝膠層析的分辨率隨柱床高度的增加而增加。因此,，柱床高度最好在60 cm以上,。

表2.推薦裝柱流速和壓力

V：所需介質(zhì)體積ml

1.15：壓縮系數(shù)（不同介質(zhì)壓縮系數(shù)不同）

r：柱管半徑cm

h：裝填高度cm

1） 用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭,，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口,，并在柱底部留出1-2 cm的去離子水,。

2） 將填料懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中,。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生,。

3） 如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水,，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面,，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡,。

4） 打開層析柱底部出口,，開啟泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行,。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱,，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液 壓對所形成柱床的沖擊,，也可以避免柱床形成的不均勻,。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速,，這樣也可以得到 一個很好的裝填效果,。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后,，在最后的裝柱流速下至少再上2 倍柱床體積的去離子水,。標(biāo)上柱床高度。

5） 關(guān)閉泵,，關(guān)閉層析柱出口,。

6） 如果使用儲液器,，去除儲液器，將分配器置于層析柱中,。

7） 將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處,。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭,。

8） 將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中,，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器,。

2.3柱效測試

為了檢驗(yàn)層析柱的質(zhì)量,，應(yīng)進(jìn)行柱效測試，以確定理論塔板數(shù)和峰不對稱系數(shù),。

洗脫液：去離子水

樣品：2% （v/v）丙酮水溶液或者1 M NaCI溶液

如圖1所示計(jì)算理論塔板數(shù),，用如下公式：N/m = 5.54 （VrM）2 x 1000/L

計(jì)算峰不對稱系數(shù)（AS）公式如下：AS = b/a （如圖1所示）

3 .純化流程

3.1緩沖液的準(zhǔn)備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 pm或0.45 pm濾膜過濾。

平衡液為蛋白純化后,，用于保護(hù)蛋白的溶液,，根據(jù)客戶需求自行選擇。

3.2樣品準(zhǔn)備

樣品在上樣前建議離心或用0.22 pm或0.45|jm濾膜過濾,，減少雜質(zhì),，防止堵塞柱子。

3.3樣品純化

1） 平衡

上樣之前,，用平衡液至少平衡兩個柱體積,，或直到基線穩(wěn)定。含去垢劑的溶液可能需要平衡更長時間,。

2） 上樣

推薦上樣體積為柱體積的2-5%o可以通過上樣管或樣品環(huán)來上樣,。純化流速最高不能超過裝柱流速的70%0

3） 再生

再生通常用水沖洗2倍柱體積,，然后用緩沖液沖洗2-3倍柱體積,，如果不立刻使用，則用20%乙醇平衡后,，4-30°C保存,。對不同的樣品, 建議大約5次循環(huán)后，采用完整的在位清洗（CIP）o

4.清洗及保存

4.1 CIP （Cleaning In Place）清洗

CIP是去除以前生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的結(jié)合過緊密,、沉淀或變性的物質(zhì),。在某些情況下，介質(zhì)再生后,，月謳或變性蛋白跡物質(zhì)仍可育誡留茁掃=o 需要制鵰料中已知污染I刎樓來設(shè)H特定的CIP程序。

當(dāng)出現(xiàn)下列情況，需要對介質(zhì)進(jìn)行在位清洗：

•柱壓增高,；

•填料顏色變化明顯,；

•分辨率降低；

•上接頭與凝膠表面之間出現(xiàn)空隙,；

•如果反壓增高,，在介質(zhì)清洗前檢查閥門,、管線等中止情況,。

1） 去除非特異性結(jié)合蛋白和脂蛋白

用0.5 M NaOH清洗一個柱體積，去離子水或緩沖液平衡至中性,，流速40 cm/ho

2） 去除一些沉淀或變性物質(zhì),，建議使用下面的方法

用4倍柱體積的1.0-2.0 M NaOH溶液，流速40 cm/h對介質(zhì)進(jìn)行清洗,，然后立即用2-3倍柱體積的水清洗,。

3） 去除一些強(qiáng)結(jié)合的疏水蛋白

用4-10倍柱體積的70%乙醇或30%異丙醇清洗（使用有機(jī)溶劑要梯度清洗，避免起泡）或者用含去垢劑的酸或中性溶液,。比如,，用1 M 醋酸溶液含0.5%非離子型去垢劑，清洗流速40 cm/h,。隨后用70%乙醇沖洗5個柱體積洗去殘留去垢劑,。

4.2保存

CIP之后的介質(zhì)如果不使用可以用20%乙醇，4 -30°C保存,。

5 .訂購信息及相關(guān)產(chǎn)品

         蘇州阿爾法生物提供的瓊脂糖凝膠介質(zhì)、葡聚糖凝膠介質(zhì)等蛋白純化和分離填料以及相關(guān)生物試劑,。另外還提供、組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化介質(zhì),、GST-tag蛋白親和純化介質(zhì),、 MBP-tag蛋白親和純化介質(zhì)、生物素Biotin-tag蛋白親和純化介質(zhì),、Strep-tagll標(biāo)簽親和純化介質(zhì)、 標(biāo)簽抗體親和純化介質(zhì)等標(biāo)簽蛋白親和層析介質(zhì),； 離子交換層析 ,、色譜柱、離子交換層析樹脂,、疏水層析介質(zhì)、 磁性微球等,。