一、各種蛋白染色方法的靈敏度比較

二,、考馬斯亮藍(lán)染色

CBB 染色液

0.5%考馬斯亮藍(lán) G250 或 R250

40%甲醇

10%乙酸

將 CBB 溶于甲醇中并不停的攪拌 15min,。加入乙酸與 ddH2O 脫色液： 30%甲醇

10%乙酸

染色方法： 1.在搖床上染色 30min.

2.脫色至蛋白點(diǎn)或條帶清晰可見

3. ddH2O 洗 3-5 次

三、膠體考馬氏亮藍(lán)染 色 Colloidal Coomassie Staining（ Cambridge centre for porteomics ）

sensitivity = ~100ng

1.  固定：甲醇/醋酸/H2 O(45:1:54) 至少 20min.

2.  染色 12-18hr,。

染色液：   17% (w/v)  硫酸銨

34%甲醇

0.5%醋酸

0.1% (w/v) Coomassie G250

3.  脫色：用 H2O 脫色至蛋白點(diǎn)和背景清晰.

雙向電泳蛋白點(diǎn)的切取和保存

1.   用 PDQuest 軟件或肉眼比對(duì),，找出感興趣的蛋白點(diǎn)，并做好標(biāo)記和記錄,。

2.   用 MilliQ  水沖洗膠 2 次,。

3.   用色譜純甲醇和 MilliQ  水沖洗 Ep 管

4.   將槍頭(200µl)下端剪去，使其內(nèi)徑略小于蛋白斑點(diǎn)的直徑,，用色譜純甲醇和 MilliQ 水沖洗槍頭,。

5.   對(duì)準(zhǔn)斑點(diǎn)中央小心將蛋白切割下來(lái)， 放入 Ep 管,，MilliQ 水漂洗 2 次,， 如膠塊 太大，將其切成 1 x 1 mm 的膠片,。

6.   將切好的點(diǎn)做好標(biāo)記和記錄,，置-80oC 保存或凍干后-20oC 存放。

注意事項(xiàng)：

1.   盡量避免皮膚和頭發(fā)的角蛋白的污染,，在操作過程中應(yīng)戴一次性的 PE 手套 （不用乳膠手套）和帽子,。

2.   不要將膠長(zhǎng)期存放于乙酸溶液中。

3.   Ep 管及染膠的容器必須用甲醇和水充分清洗,， 尤其應(yīng)與進(jìn)行 Western blotting 的容器分開,，以避免 casein 或 BSA 的污染。