樣品制備原則

樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步,，將直接影響 2-DE 結(jié)果好壞,。目前并 沒有一個通用的樣品制備方法， 盡管處理方法多種多樣,， 但都遵循幾個基本的原 則： 1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度,，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的 損失,； 2）減少對蛋白質(zhì)的人為修飾,； 3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作

用，并使蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài),。

根據(jù)這一原則,，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes), 主要包 括尿素（Urea）和硫脲（thiourea ）；表面活性劑（sufactants）,，也稱去垢劑,，

如 CHAPS 與 Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducing agents）,，常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等,。當(dāng)然，也可以選擇性 的加入 Tris-base, 蛋白酶抑制劑以及核酸酶,。樣品的來源不同,，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合,， 以達(dá)到對樣品蛋白的最大抽提,。在對樣品蛋白質(zhì)提取的過程中,， 必須考慮到去除 影響蛋白質(zhì)可溶性和 2DE 重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸,、脂,、多糖等大分子以及鹽  類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑,，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓,， 甚至?xí)p壞 IPG 膠條，這樣都會造成 2-DE 的失敗,。樣品制備的失敗很難通過后

續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償,。

核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理， 超聲處理應(yīng)控制好條件,， 并防止產(chǎn)生 泡沫,； 而加入的外源核酸酶則會出現(xiàn)在最終的 2D 膠上。脂類和多糖都可以通過 超速離心除去,。透析可以降低鹽濃度,， 但時間太長； 也可以采取凝膠過濾或沉淀 /重懸法脫鹽,，但會造成蛋白質(zhì)的部分損失,。

因此， 樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品,、所處的狀態(tài)以及實驗?zāi)康暮鸵?nbsp;來進(jìn)行選擇,。 目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細(xì)胞的總蛋白提取物,、亞細(xì) 胞組份或細(xì)胞器蛋白,、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、 采用 親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）,。

一,、細(xì)胞樣品

1.    細(xì)胞培養(yǎng)，加藥與處理,。

2.    胰酶消化貼壁細(xì)胞,， PBS 漂洗 3 次(1500g, 5min) ，棄上清,  再次離心,，去 盡殘液（ 非常重要?。Ｈ缫容^細(xì)胞膜蛋白組的差別,， 最好用細(xì)胞刮收獲細(xì) 胞,。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS,，可有效降低樣品的 鹽濃度,。加入 5 倍體積裂解液,，混勻（或?qū)?nbsp;1× 106  細(xì)胞懸于 60 ～ 100µl 裂解液 中 ）。 

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ,，在 4℃放置 15 分鐘,。

4.    15,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn),， 4℃離心 30 分鐘 ）,。 

5.    收集上清。

6.    測定蛋白濃度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit),。

7.    分裝樣品,，凍存于－70℃。

二,、組織樣品

1.   碾缽碾磨組織,，碾至粉末狀。

2.   將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器,，加入適量裂解液,，進(jìn)行勻漿。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase,，在 4℃放置 15 分鐘,。

4.   15,000 轉(zhuǎn)， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuǎn),， 4℃離心 30 分鐘 ）,。 

5.   收集上清，測定蛋白濃度,。

6.    分裝樣品,，凍存于－70℃。

注意事項：

1.   8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用,，否則 PMSF 會失去活性,。 

2.  40 mmol/L 濃度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3.   細(xì)胞清洗―― 大多用 PBS,，若 PBS 殘留于細(xì)胞表面會造成膠上出現(xiàn)水平條紋 ,，

則可利用(10 mmol/LTris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此問題。 

雙向電泳操作步驟

水化上樣(被動上樣)

1.    從冰箱中取出 IPG 膠條,，室溫放置 10min,。

2.    沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣,，中間 的樣品液一定要連貫.注意：不要產(chǎn)生氣泡,， 否則會影響膠條中蛋白質(zhì)的分布。

3.    用鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的保護(hù)層,。 注意：堿性端較脆弱,，應(yīng)小心操作,。

4.    將IPG 膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上.注意:不要將樣品溶液弄到 膠條背面, 因為這些溶液不會被膠條吸收;還使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如產(chǎn) 生了氣泡,，用鑷子輕輕地提起膠條的一端,，上下移動膠條，直到氣泡被趕走,。

5.    放置 30~45min 大部分樣品被膠條吸收,， 沿著膠條緩慢加入礦物油， 每根膠條

約 3ml(17cm IPG),，防止膠條水化過程中液體蒸發(fā),。

6.    置等電聚焦儀于-20℃水化 11~15h。

一向 等電聚焦

1.    將紙電極置于聚焦盤的正負(fù)極上,，加 ddH2O 5~8µl 潤濕,。

2.    取出水化好的膠條，提起一端將礦物油瀝干,，膠面朝下,，將其置于剛好潤濕 的濾紙片上雜交以去除表面上的不溶物。

3.    將 IPG 膠條膠面朝下置于聚焦盤中,， 膠條的正極（標(biāo)有+ ）對應(yīng)于聚焦盤的正極,，確保膠條與電極緊密接觸。

4.    在每根膠條上覆蓋 2-3ml 礦物油,。

5.    對好正,、負(fù)極，蓋上蓋子,。設(shè)置等電聚焦程序,。

6.    聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡,、第二向 SDS-PAGE 電泳,。或?qū)⒛z條置于樣

品水化盤中,， -20℃冰箱保存,， 電泳前取出膠條， 室溫放置 10 分鐘,， 使其溶解,。

第二向 SDS-PAGE 電泳

1.    配制 12%的丙烯酰胺凝膠。

2.    待凝膠凝固后,， 倒去分離膠表面的 MilliQ  水,、乙醇或水飽和正丁醇， 用MilliQ 水沖洗,。

3.    配制膠條平衡緩沖液 I

4.    在桌上先放置干的厚濾紙,， 聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上,。將另 一份厚濾紙用 MilliQ 水浸濕，擠去多余水分,，然后直接置于膠條上，輕輕吸 干膠條上的礦物油及多余樣品,，這樣可以減少凝膠染色時出現(xiàn)的縱條紋,。

5.    將膠條轉(zhuǎn)移至樣品水化盤中，加入 6ml(17cm IPG)平衡緩沖液 I,，在水平搖床 上緩慢搖晃 15 分鐘,。

6.    配制膠條平衡緩沖液 II。

7.    第一次平衡結(jié)束后,，取出膠條將之豎在濾紙上瀝去多余的液體,，放入平衡緩 沖液 II 中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃 15 分鐘,。

8.    用濾紙吸去 SDS-PAGE 膠上方玻璃板間多余的液體,， 將二向凝膠放在桌面上，

凝膠的頂部面對自己,。

9.    將瓊脂糖封膠液加熱溶解,。

10.  在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。

11.  第二次平衡結(jié)束后,，取出膠條,，用濾紙吸去多余的平衡液（將膠條豎在濾紙 上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面）,。

12.  用鑷子夾住膠條的一端使膠面全浸末在 1× 電泳緩沖液中漂洗數(shù)次,。

13.  將膠條背面朝向玻璃板，輕輕放在長玻板上,，加入低熔點瓊脂糖封膠液,。

14.  用適當(dāng)厚度的膠片, 輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面全接 觸.注意:不要在膠條下方產(chǎn)生氣泡， 應(yīng)推動凝膠背面的支撐膜,， 不要碰到膠面,。

15.  放置 5 分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固,。

16.  打開二向電泳制冷儀,，調(diào)溫度為 15℃。

17.  將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中,，加入電泳緩沖液,，接通電源，起始時用的低電流 （5mA~10mA/gel/17cm ）,，待樣品在全走出 IPG 膠條,， 濃縮成一條線后,， 再 加 大 電流（20-30mA/gel/17cm ）待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時即可停止電泳。

 18.  電泳結(jié)束后,，輕輕撬開兩層玻璃,，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套,，防止污染膠面）,。

19.  進(jìn)行染色。

更多實驗室儀器,、實驗室設(shè)備,、實驗耗材進(jìn)入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司進(jìn)行了解。