外泌體（Exosome）發(fā)現(xiàn)于1986年，是一種直徑約30~100nm的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)小體,，可由機體內(nèi)多種細(xì)胞如免疫細(xì)胞,、干細(xì)胞、心血管細(xì)胞,、網(wǎng)織紅細(xì)胞,、血小板、神經(jīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等主動分泌產(chǎn)生,，廣泛分布于外周血,、尿液、唾液,、乳汁,、腹水、羊水等體液中,。 外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子,、生長因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通訊,、細(xì)胞遷移,、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關(guān)[1][2],。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能,，使得它具有潛在的應(yīng)用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標(biāo),，另一方面也可以作為治療手段,，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。
外泌體的分離純化一直是科研工作者關(guān)注的問題,，獲得高純度的外泌體對后續(xù)的研究至關(guān)重要,。據(jù)了解，目前人們多采用超速離心,、免疫磁珠,、超濾、沉淀或試劑盒等方法實現(xiàn)外泌體的提取分離：
1,、超速離心法（差速離心）超離法是常用的外泌體純化手段,，采用低速離心、高速離心交替進行（如圖所示）,，可分離到大小相近的囊泡顆粒,。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎,，但過程比較費時,，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑,；此外,，重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量[3],。
2,、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層,，是一種區(qū)帶分離法,。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集,。此法獲得的外泌體純度較高,，但步驟繁瑣，耗時,。
3,、超濾離心：由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體,，大于一般蛋白質(zhì)，利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離,，便可獲得外泌體,。超濾離心法簡單高效，且不影響外泌體的生物活性,，是提取細(xì)胞外泌體的一種新方法,。
4、磁珠免疫法：外泌體表面有其特異性標(biāo)記物（如CD63,、CD9蛋白）[5],，用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來,。磁珠法具有特異性高,、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點,，但是效率低,，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗,，難以廣泛普及,。
5、PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀,，早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體,，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān),。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性）,，顆粒大小不均一,，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會破壞外泌體等,，因此發(fā)表文章時易受質(zhì)疑,。
6、試劑盒提?。航鼛啄陙?，市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設(shè)計的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分,，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化,，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。這些試劑盒不需要特殊設(shè)備,，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代,，提取效率和純化效果逐漸提高,，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。有些試劑盒操作簡便,，不用超速離心,，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體——如101bio開發(fā)的系列試劑盒，可分別針對尿液,、血液,、細(xì)胞上清液等多種樣品進行提取[6][7]，并可進一步從外泌體中獲得想要的蛋白質(zhì)或者RNA分子,，方便快速,，因而受到大多數(shù)人的歡迎，并發(fā)表了不少高質(zhì)量的文章,！
然而,，市場上各類產(chǎn)品純化效果良莠不齊，目前仍沒有絕對的方法或試劑盒能滿足所有要求,，從各類樣品中分離到理想的外泌體,。
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