外泌體為何物?相信看過外泌體科普文的童鞋們都已經(jīng)很熟悉了，在此小編就不再贅述,，這里主要針對外泌體的進(jìn)展及獲取兩方面談?wù)剛€人觀點,。
在剛剛過去的2020年，盡管科學(xué)研究受疫情影響,，但外泌體研究領(lǐng)域仍然取得了諸多進(jìn)展,。據(jù)統(tǒng)計，在基礎(chǔ)研究方面,，2020年外泌體領(lǐng)域發(fā)表文獻(xiàn)約4000多篇,，較2019年發(fā)表數(shù)量增長27%;在藥物開發(fā)領(lǐng)域，相比于細(xì)胞療法,，外泌體治療*的優(yōu)勢為當(dāng)前一些難治疾病的治療或者難以成藥靶點的藥物開發(fā)帶來一些新的機(jī)會,。
一方面，外泌體代替細(xì)胞治療,，避免了細(xì)胞治療帶來的免疫排斥和致瘤爭議;另一方面,，外泌體膜表面組織特異性抗原的表達(dá)為器官、組織,、細(xì)胞靶向性的藥物開發(fā)提供了生物學(xué)基礎(chǔ),。復(fù)雜的膜組分可以讓外泌體通過表面的蛋白相互作用，或者進(jìn)入靶細(xì)胞來發(fā)揮作用,，這使得藥物的作用方式更加多元化,。另外，外泌體的免疫原性很低,，可以重復(fù)給藥,，且外泌體可以無創(chuàng)性地通過許多組織屏障(例如血腦屏障等)。
隨著外泌體研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的日益火爆,，外泌體需求與日俱增,。除了依靠自己制備之外，市場上提供外泌體制備服務(wù)的公司也如雨后春筍般不斷涌現(xiàn),。如何獲取一款適合自己應(yīng)用所需且純度高的外泌體就成了一道難題,。以下，就如何選擇適合自己的可靠外泌體談?wù)剛€人看法,。
一,、看外泌體來源
要根據(jù)個人研究或使用需求選擇合適來源的外泌體。
外泌體的細(xì)胞來源非常之廣泛,，包括幾乎所有種類的細(xì)胞都會分泌外泌體,，但不同來源的外泌體具有不同功能,。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體也具備了很多間充質(zhì)干細(xì)胞的功能,，比如血管新生,、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)功能等;神經(jīng)干細(xì)胞來源的外泌體可能更能促進(jìn)神經(jīng)再生;而腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體則在腫瘤的生長,、轉(zhuǎn)移和腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)過程起著重要作用,。我們可以根據(jù)自己的應(yīng)用方向和需求選擇合適的外泌體來源。
二,、看外泌體純化方式
外泌體的提取方法有多種：包括傳統(tǒng)的差速離心,、密度梯度離心，以及后來發(fā)展的超濾法,、聚合物沉淀法,、免疫分離、隔離篩選法,、體積排阻色譜法等,。這些方法各有利弊。
外泌體純化的方式多種多樣,，目前存在的主流方式主要包括超速離心法,、基于PEG-base沉淀法開發(fā)的試劑盒提取方式、磁珠免疫法,、超濾離心法等等,。這幾種外泌體提取的方法各有優(yōu)缺點。下圖是試劑盒提取外泌體以及超速離心提取的外泌體幾種指標(biāo)的鑒定比較,。
超速離心是從生物體液或細(xì)胞上清分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)方法,。采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行,，可分離到大小相近的囊泡顆粒,。目前在國外的重要期刊如Cell、Nature,、Science以及其眾多子刊中,，超速離心是普遍應(yīng)用的經(jīng)典技術(shù)手段。
實驗結(jié)果表明超速離心獲取的外泌體純度更高,，均一性更好，具有更小的粒徑,，但相對于PEG-base沉淀法,，超速離心法的產(chǎn)量不高。二者都是實驗室常用的外泌體提取方法,，小編認(rèn)為,，我們可以根據(jù)各自的實驗或應(yīng)用的需求選擇相應(yīng)的方法,，例如對于分子機(jī)制研究或載體的應(yīng)用，建議使用超離法提取外泌體,，獲取更高純度的外泌體,，以減少雜質(zhì)對應(yīng)用結(jié)果的干擾。
四,、外泌體三大質(zhì)檢驗證,，符合鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”
外泌體經(jīng)細(xì)胞分泌后存在于體液或者血液中，故外泌體的制備與提取一般為血液（全血,、血漿）,、體液（尿液、唾液,、腦脊液,、羊水、唾液等）,、細(xì)胞上清液,。
國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會于2014年發(fā)布的一個指導(dǎo)性聲明文件，文件指出了目前研究和定義細(xì)胞外囊泡及其功能所需要的最少實驗要求,。這個聲明文件發(fā)表在《細(xì)胞外囊泡雜志》上,。目前該聲明正在籌劃更新。
據(jù)國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會（ISEV）在2014年的提議,，外泌體鑒定分為三個層面：透射電鏡（transmissionelectronmicroscope,，TEM）、Nanosight粒徑,、蛋白標(biāo)志物,。
NTA粒徑分析
納米顆粒跟蹤分析（NanoparticleTrackingAnalysis,NTA）是對每個顆粒的布朗運動進(jìn)行追蹤和分析，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計算出納米顆粒的流體力學(xué)直徑和濃度,，檢測10nm–1000nm范圍內(nèi)的顆粒,。NTA技術(shù)已被外泌體研究領(lǐng)域認(rèn)可為外泌體表征手段之一；相較于其他表征方式,，NTA技術(shù)的樣本處理更簡單,、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快,。
外泌體電鏡分析
雙層囊膜結(jié)構(gòu)（茶托狀）是外泌體重要標(biāo)志之一,，但普通光學(xué)顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結(jié)構(gòu)。而透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscope,TEM)分辨率可達(dá)0.1-0.2nm,，可將被觀察物體放大至數(shù)百萬倍,，是外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀測的經(jīng)典方法。
外泌體標(biāo)志物鑒定
通過對經(jīng)典文獻(xiàn)中普遍采用的抗體進(jìn)行驗證和挑選,，優(yōu)選了多種外泌體標(biāo)志物抗體,，如CD9,、CD63、CD81,、HSP70,、TSG101、Alix等,。
五,、外泌體的保存及運送
外泌體應(yīng)低溫保存；短時間（一般1周以內(nèi)）可放4℃,，長時間可放-20℃或者-80℃,，并避免反復(fù)凍融。
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