細(xì)胞名稱： 人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞(5-8F)說明書

細(xì)胞特性：

1） 來源：鼻咽癌

2）  形態(tài)：貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用,。

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系,。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨,，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時聯(lián)系我們,。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況,，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會因振動脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上,，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中,，若因運(yùn)輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收,。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 ,。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備1640 培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%,；P/S雙抗,，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%,。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清,，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間）,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化,。 

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例,；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中,，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度,。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ,，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中,，標(biāo)注好名稱、代數(shù),、日期等信息,。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存,。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏,，并會慢慢充滿液氮,。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

鼻咽癌相關(guān)知識：

流行病學(xué)

鼻咽癌可發(fā)生在各個年齡段，但以30-60歲多見,，占75%-90%,。具有明顯的地區(qū)聚集性、種族易感性,、家族高發(fā)傾向,。

病理

鼻咽癌以鱗癌最為常見，約占95%以上,。2001年WHO將鼻咽癌組織學(xué)分類為:角化型鱗狀細(xì)胞癌,、非角化型癌（大部分）、基底樣鱗狀細(xì)胞癌,。

生長與轉(zhuǎn)移

鼻咽癌好發(fā)于鼻咽側(cè)壁（尤其是咽隱窩）和頂后壁,。鼻咽癌的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生早,、轉(zhuǎn)移率高。中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院統(tǒng)計,，確診時有70%-80%的患者已有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,，40%-50%的 患者發(fā)生雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常見的部位是骨,，其次是肺,、肝，且常為多個器官同時發(fā)生,。

臨床表現(xiàn)

常見為回吸性涕血,、鼻塞、耳鳴和聽力減退,、頭痛以及面麻,、復(fù)視等顱神經(jīng)損害相關(guān)癥狀。

人高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞系 5-8F  1640+10%FBS+1%P/S    貼壁生長

人鼻咽癌細(xì)胞 C666-1 1640+10%FBS +1%P/S 貼壁生長

人鼻咽癌細(xì)胞 NPC/HK-1 1640+10%FBS +1%P/S 貼壁生長

豬鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞 PT-K75 DMEM+10%FBS+1%P/S 貼壁生長