原代細(xì)胞培養(yǎng)之分離注意事項(xiàng)

1、組織塊培養(yǎng)法

1）組織塊接種后的前3天,，在觀察和移動的過程中,，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動和振動,，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起,。

2）加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來,。

3）當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞,，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細(xì)胞的生長,。

4）為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上,，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

2,、貼壁型原代細(xì)胞

1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時,，它們之間會互相影響，在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì),，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長,。如果接種的細(xì)胞密度過低，細(xì)胞之間的促生長作用很小,，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過程,。如果接種的細(xì)胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足,，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代,。

2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度,，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細(xì)胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率,。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng),。

3）盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵,?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細(xì)胞貼壁后,，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

3、懸浮型原代細(xì)胞

1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài),?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物,。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是,，以5ml為低限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細(xì)胞造成傷害,。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快,，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下,，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時要注意不要吸出細(xì)胞。

2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,，其生命力一般都比較旺盛,，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大,，換液時間隔一般較短,。

原代細(xì)胞培養(yǎng)問題解答

1、原代細(xì)胞與細(xì)胞系有什么區(qū)別,？

根據(jù)傳統(tǒng)定義,，自組織第一次收獲和接種的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 這類細(xì)胞直接從組織分離，生命周期有限,，經(jīng)數(shù)次傳代后會逐漸停止生長,。原代細(xì)胞在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的最大生長空間，以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性,。

細(xì)胞系是不斷生長,、分化的細(xì)胞群，因其經(jīng)過遺傳改造,，致使其具有無限增長的潛能,。體外生長的細(xì)胞系用于醫(yī)療或科研,。

但實(shí)際上，經(jīng)過長時間,、連續(xù)的傳代培養(yǎng)后,，細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變,。

需要指出的是,，在不同的科研小組中這些術(shù)語的定義會有所不同。許多研究員不用細(xì)胞系這個詞表示細(xì)胞群,，除非細(xì)胞經(jīng)過了遺傳改造,。 

2、倍增和代數(shù)有什么區(qū)別,？

倍增是培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的翻倍,，通常是指細(xì)胞指數(shù)或?qū)?shù)生長期。代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)瓶中移出,，傳代培養(yǎng)過程的次數(shù),，傳代培養(yǎng)的目的，是使細(xì)胞處于低密度以刺激其進(jìn)一步生長,。 

3,、接收到的凍存細(xì)胞該如何處理？

收到包裝箱后,，立即將凍存細(xì)胞從干冰移入液氮中凍存,。此過程盡量快，以避免升溫,。不要將細(xì)胞儲存在-80℃,，這樣會對細(xì)胞造成不可挽回的傷害。 

4,、凍存的細(xì)胞該如何開始培養(yǎng),？

(1) 將一管細(xì)胞從液氮罐中取出，注意保護(hù)手和眼睛,。

(2) 將凍存管快速的放入37℃水浴中,，輕輕握住并旋轉(zhuǎn)，直到管內(nèi)物體*融化,。

(3) 將凍存管立即從水浴中拿出，擦干,，轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境,。

(4) 用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精,。

(5) 打開蓋子,，注意手指不要碰到里面的螺紋（注意,，由于凍存管有負(fù)壓，開蓋時可能會有少量溢出,，這是正?，F(xiàn)象）。

(6) 用多聚賴氨酸（或參照說明書）包被培養(yǎng)瓶,。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個細(xì)胞,。

(7) 蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻,。若需要?dú)怏w交換可打開蓋子,。

(8) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2,，95%空氣）

(9) 放入培養(yǎng)箱后第6-16小時更換一次培養(yǎng)基,，以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細(xì)胞。 

5,、細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，多久更換一次培養(yǎng)基？

這取決于細(xì)胞生長的速度,。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基,，許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常在周一，周三,，周五更換培養(yǎng)基,。

注意：凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，在6-16小時內(nèi)更換培養(yǎng)基,，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細(xì)胞,。 

6、我能擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細(xì)胞嗎,？

這取決于細(xì)胞的類型,。一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長緩慢的上皮細(xì)胞,，不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存,。其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞,、腎系膜細(xì)胞,、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等，可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存,。

然而,，需要注意的是再次凍存的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長性能的改變。

7、培養(yǎng)瓶中應(yīng)該加入多少體積的培養(yǎng)基,？

我們推薦的用量為：T-25培養(yǎng)瓶5ml,，T-75培養(yǎng)瓶15ml，T-150培養(yǎng)瓶30ml,。