原代細(xì)胞培養(yǎng)之分離注意事項(xiàng)

1,、組織塊培養(yǎng)法

1）組織塊接種后的前3天,，在觀察和移動(dòng)的過(guò)程中，注意不要引起液體的振蕩,。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng),，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。

2）加入的培養(yǎng)液不宜過(guò)多,，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來(lái),。

3）當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來(lái)后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng),。

4）為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上,，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

2,、貼壁型原代細(xì)胞

1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí),，它們之間會(huì)互相影響，在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì),，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng),。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小,，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過(guò)程,。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足,，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代,。

2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度,，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用,，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng),。

3）盡快使接種的細(xì)胞貼壁,，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h,，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。

3,、懸浮型原代細(xì)胞

1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。可以通過(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物,。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為低限度,，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害,。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染,。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下,，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞,。

2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快,，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大,，換液時(shí)間隔一般較短。

原代細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題解答

1,、原代細(xì)胞與細(xì)胞系有什么區(qū)別,？

根據(jù)傳統(tǒng)定義，自組織第一次收獲和接種的細(xì)胞被稱為原代細(xì)胞 [Freshney, R.I. (1987). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. (New York, Alan R. Liss, Inc.)]. 這類細(xì)胞直接從組織分離,，生命周期有限,，經(jīng)數(shù)次傳代后會(huì)逐漸停止生長(zhǎng)。原代細(xì)胞在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的最大生長(zhǎng)空間,，以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性,。

細(xì)胞系是不斷生長(zhǎng)、分化的細(xì)胞群,，因其經(jīng)過(guò)遺傳改造,，致使其具有無(wú)限增長(zhǎng)的潛能。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞系用于醫(yī)療或科研,。

但實(shí)際上,，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)的傳代培養(yǎng)后,，細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加,，細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變。

需要指出的是,，在不同的科研小組中這些術(shù)語(yǔ)的定義會(huì)有所不同,。許多研究員不用細(xì)胞系這個(gè)詞表示細(xì)胞群，除非細(xì)胞經(jīng)過(guò)了遺傳改造,。 

2,、倍增和代數(shù)有什么區(qū)別,？

倍增是培養(yǎng)物中細(xì)胞總數(shù)的翻倍，通常是指細(xì)胞指數(shù)或?qū)?shù)生長(zhǎng)期,。代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)瓶中移出,，傳代培養(yǎng)過(guò)程的次數(shù)，傳代培養(yǎng)的目的,，是使細(xì)胞處于低密度以刺激其進(jìn)一步生長(zhǎng),。 

3、接收到的凍存細(xì)胞該如何處理,？

收到包裝箱后,，立即將凍存細(xì)胞從干冰移入液氮中凍存。此過(guò)程盡量快,，以避免升溫,。不要將細(xì)胞儲(chǔ)存在-80℃，這樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可挽回的傷害,。 

4,、凍存的細(xì)胞該如何開(kāi)始培養(yǎng)？

(1) 將一管細(xì)胞從液氮罐中取出,，注意保護(hù)手和眼睛,。

(2) 將凍存管快速的放入37℃水浴中，輕輕握住并旋轉(zhuǎn),，直到管內(nèi)物體*融化,。

(3) 將凍存管立即從水浴中拿出，擦干,，轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境,。

(4) 用70％的酒精沖洗凍存管，然后擦去多余酒精,。

(5) 打開(kāi)蓋子,，注意手指不要碰到里面的螺紋（注意，由于凍存管有負(fù)壓,，開(kāi)蓋時(shí)可能會(huì)有少量溢出,，這是正常現(xiàn)象）,。

(6) 用多聚賴氨酸（或參照說(shuō)明書(shū)）包被培養(yǎng)瓶,。多數(shù)細(xì)胞推薦的接種密度為每平方厘米5000個(gè)細(xì)胞。

(7) 蓋好培養(yǎng)瓶的蓋子,，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶以使細(xì)胞分布均勻。若需要?dú)怏w交換可打開(kāi)蓋子,。

(8) 將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中（37℃,，5%CO2,，95%空氣）

(9) 放入培養(yǎng)箱后第6-16小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，以去除殘留的二甲基亞楓和未貼壁的細(xì)胞,。 

5,、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，多久更換一次培養(yǎng)基,？

這取決于細(xì)胞生長(zhǎng)的速度,。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基，許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室通常在周一,，周三,，周五更換培養(yǎng)基。

注意：凍存細(xì)胞復(fù)蘇后,，在6-16小時(shí)內(nèi)更換培養(yǎng)基,，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細(xì)胞。 

6,、我能擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細(xì)胞嗎,？

這取決于細(xì)胞的類型。一些細(xì)胞類型像神經(jīng)細(xì)胞,，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和一些生長(zhǎng)緩慢的上皮細(xì)胞,，不推薦擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存。其它的細(xì)胞類型像成纖維細(xì)胞,、星形細(xì)胞,、腎系膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等等,，可以擴(kuò)增培養(yǎng)和再次凍存,。

然而，需要注意的是再次凍存的過(guò)程可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)性能的改變,。

7,、培養(yǎng)瓶中應(yīng)該加入多少體積的培養(yǎng)基？

我們推薦的用量為：T-25培養(yǎng)瓶5ml,，T-75培養(yǎng)瓶15ml,，T-150培養(yǎng)瓶30ml。