蘇州千舍生物提示細胞培養(yǎng)需注意事項

細胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重,。實驗君的很多成果可謂是成也細胞培養(yǎng)，敗也細胞培養(yǎng)。然而細胞虐我千百遍，我待細胞如初戀！科研人是不會這么被輕易打敗的,。

1.新買的細胞如何處理？

細胞剛拿到手應趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂,；培養(yǎng)基是否漏出,，是否渾濁；是否有支原體污染,；迅速擴增凍存,。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應,，造成細胞無法存活,。

3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見原因可能有：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳,；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后,，加以洗滌細胞和離心,；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達不到要求,；細胞置于 –80 ℃ 太久,。

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落的原因,？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂,，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊,。

5.冷凍管應如何解凍,？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全,，可佩戴防護眼鏡和手套預防冷凍管的爆裂,。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形,。

6.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除 DMSO,？

現(xiàn)在大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去,，但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）,，在解凍之后,，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可,，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題,。

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

Hyclone胎牛血清SH30084.03  ,、Hyclone胎牛血清SH30406.02  ,、Hyclone胎牛血清SH30406.05 、Hyclone胎牛血清SH30396.03  、Hyclone胎牛血清SH30070.03

特級胎牛血清 SH30070.03E ,、Hyclone胎牛血清 SH30370.03  ,、活性炭/葡聚糖胎牛血清 SH30068.03  、活性炭/葡聚糖處理胎牛血清,，熱滅活 SH30068.03HI ,、馬血清SH30074.03  、烏拉圭胎牛血清 SV30087. 03 ,、Hyclone胎牛血清SH30071.03 ,、Hyclone胎牛血清SV30160.03。

BOVOGEN胎牛血清 SFBS ,、BOVOGEN新生牛血清 SNCS,。

PAA 普通胎牛血清FBS A15-101 、PAA 優(yōu)等胎牛血清FBS A15-151,。

BI優(yōu)等胎牛血清 04-001-1ACS ,、BI ES級別胎牛血清 04-002-1A 、

BI 間充質(zhì)胎牛血清 04-400-1A ,。

Corning胎牛血清 35-076-CV,。

PAN胎牛血清FBS P30-3302  、PAN胎牛血清FBS ST30-3302 ,、PAN ES級別胎牛血清 ST30-2602 ,、PAN胎牛血清Plus ST30-3302P 。

NTC優(yōu)等胎牛血清 SFBE,。

Gemini優(yōu)等胎牛血清 900-108 ,、Gemini特級胎牛血清 100-500  、Gemini科研用人AB血清100-512 ,。

TCB胎牛血清 101ZC,。

Sigma 特級胎牛血清F2442 、Sigma正常人AB血清 H4522 ,。

SBI 無外泌體血清 EXO-FBS-50A-1

胎牛血清盒裝A31608-02,、馬血清16050-122。

雙抗15140-122,、SV30010  ,、胰酶 25200-056、SH30042.01 ,、GIBCO 胰酶 25200-072,。

MCF7/Taxol人乳腺癌紫杉醇耐藥株

HCT8/5-fu 人回腸直腸腺癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

LOVO/5-FU 人結(jié)腸癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

HCT116/L人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細胞

HL60/ADR人早幼粒急性白血病細胞耐阿霉素株

PC9GR(PC9R)人肺癌細胞耐吉非替尼

LOVO/ADR人結(jié)腸癌細胞阿霉素耐藥株

HNE1/DDP人鼻咽癌細胞順鉑耐藥株

SGC7901/5-fu人胃癌細胞五氟尿嘧啶耐藥株

A549/DDP人肺癌細胞順鉑耐藥株

MCF-7/DDP人乳腺癌細胞順鉑耐藥株

A549/ADR人肺癌細胞阿霉素耐藥株

SGC7901/DDP人胃癌細胞順鉑耐藥株

SKOV3/DDP人卵巢癌細胞順鉑耐藥株

HELA/DDP人宮頸癌耐順鉑細胞株

NCI-H1650 人肺支氣管癌細胞

RT4 人膀胱移行細胞乳頭瘤 、SK-N-MC 人神經(jīng)上皮瘤細胞

SK-N-SH 人神經(jīng)母細胞瘤細胞 ,、SW982 人滑膜肉瘤細胞

T98G 人膠質(zhì)母細胞瘤 ,、U251MG(KO) 人類星形膠質(zhì)細胞瘤細胞

U266 人骨髓瘤細胞 、VCAP 人前列腺癌細胞

hTERT-HPNE 人胰腺導管細胞 、ES-2 人卵巢透明細胞癌細胞

NCI-H1650人非小細胞肺癌細胞 ,、H460 人大細胞肺癌細胞

HACAT 人永生化角質(zhì)形成細胞 ,、HCT116 人結(jié)腸癌細胞

HEK293 人胚腎細胞  、HEPG2 人肝癌細胞

HGC27 人胃癌細胞(未分化) ,、HT-29 人結(jié)腸癌細胞

HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 ,、KYSE150人食道癌細胞

L02(HL7702)人正常肝細胞   、LOVO 人結(jié)腸癌細胞

MCF-10A人正常乳腺上皮細胞 ,、MCF7人乳腺癌細胞

LX-2 人肝星狀細胞 ,、MDA-MB-468人乳腺癌細胞

8.如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞,，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長?？傊?，shou選 MEM 做粘附細胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始,。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色,，堿性時為紫色。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞,，尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時,，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

10.細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應該注意什么,？

細胞培養(yǎng)基配好后,，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測培養(yǎng)液是否有污染,，然后方可用于實驗,。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個批號試用效果良好后,，就可一次購入較多同一批號的血清,，這樣實驗條件穩(wěn)定，配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜,，一次配液不要太多,，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充，二是量大易造成污染,。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,，顏色會偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色,。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,，可以通入無菌過濾 CO2,，以調(diào)整 pH 值。

12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基,？

對于應用培養(yǎng)細胞進行分離制備細胞生長因子,、單克隆抗體等應該選擇無血清培養(yǎng)基。

13.如何選擇正確的血清種類,？

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類,？

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響,。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活,。

15.血清滅活是否必須？

這個問題現(xiàn)在有爭議,。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子,，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì),，而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子,，氨基酸等成分帶來的負面影響。盡管如此,，在大多數(shù)實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行,，尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)中。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素,？

除特殊篩選系統(tǒng)中外,，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

17.何時更換培養(yǎng)基,？

視細胞生長密度而定,，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,。

18.細胞傳代的方法都有哪些,？

根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代,；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代,；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后,，再吹打,。

19.原代培養(yǎng)的*傳代應注意的問題？

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,，不要急于傳代,；原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間,，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理,，并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷,；*傳代時細胞接種數(shù)量要多一些,，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶,。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的,？應如何處理？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和,，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+,，這些離子是維持組織完整的重要因素,。但EDTA單獨使用不能使細胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用,，效果較好,。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%,，用不含Ca2+,、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA,，在終止消化前,，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液,。di一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃,，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低,，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細胞離心下來,，其離心速率應為多少轉(zhuǎn)速,？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm,，5~10 分鐘,，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡,。

22.細胞的接種密度為何,？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一,。

23.細胞交叉污染的可能原因,？

多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開,，往往會使一種細胞被另一種細胞污染,。

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時,，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶,，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡,。目前多采用甘油和DMSO做保護劑,。這兩種細胞無明顯毒性，分子量小,，溶解度大,，易穿透細胞，可以使冰點下降,，提高包膜對水的通透性,。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的 DMSO 等級,，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO,，其本身即為無菌狀況，di一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,，保存于 4 ℃,，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機會,。若要過濾 DMSO,，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜,。

26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度,？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細胞的方法,？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存,。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存,。–20 ℃ 不可超過 1 小時,，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中,，存活率稍微降低一些。

28.細胞凍存太多會不會浪費,？

每一種細胞系都應有充足的凍存儲備,，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細胞狀態(tài)都不同,，應該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種,。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發(fā)生改變,。

29.如何識別和預防常見的細胞污染,？

細菌污染：細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計,。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌,、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見,。

一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn),，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生,，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象,；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩,，就有很多混濁物漂起,。倒置顯微鏡下觀察,，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染,，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種,，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min,，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng),，24h可得結(jié)果,。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多,、增粗,，zui后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失,。

看到這種,，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢,，基本原則立馬扔掉,，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴,，先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍,，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉素、新霉素（50ug/ml）等,，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng),。

真菌污染：是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染,。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉,、黑曲霉、毛霉菌,、孢子霉,、白念珠菌、酵母菌等,。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物,。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn),，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁,，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀,、及樹枝狀菌絲,，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠,；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時,，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆,。真菌污染后，細胞生長變慢,，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡,。

真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散,，可能這瓶沒9過來,，又擴大了污染，建議預防為主,，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅,，就是藍色的那種東西。哎,，如果你非救不可,，可以采用兩性霉素B（0.25-2.5），三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液,。

支原體污染：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(zui小直徑0．2um)并獨立生活的微生物,。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性,?？蔀閳A形、絲狀或梨形,。

支原體形態(tài)多變,，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu),。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束,。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似,，但微絨毛電子密度比支原體小,，且中央無顆粒群或中央束。

支原體污染細胞后,，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁,。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代,、換液而緩解,，因此易被忽視。但個別嚴重者,，可致細胞增殖緩慢,，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

如果懷疑細胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理,。

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