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BioRadPCR儀,；伯樂PCR儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標準的PCR反應(yīng)體系：

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補,，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶,。

⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,，被擴增的靶序列好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。

Bio-Rad-pcr儀 - 工作原理,；

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物,。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時  聚合酶鏈式反應(yīng)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。

每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

Bio-Rad-熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。

現(xiàn)將其原理簡述如下：

熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團,。探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時,，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步,。