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Bio-Rad-pcr儀 - 工作原理,；
類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。
每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。
Bio-Rad-熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料,。
現(xiàn)將其原理簡述如下：
熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán),。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,；PCR擴(kuò)增時(shí),，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步,。
BioRadPCR儀,；伯樂PCR儀反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3’端的互補(bǔ),，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶,。
⑤引物3’端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列好有適宜的酶切位點(diǎn),，這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。