前兩期,，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）和脂肪來(lái)源干細(xì)胞凍存的相關(guān)研究,，發(fā)現(xiàn)向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復(fù)合型凍存保護(hù)劑,，可以提升干細(xì)胞長(zhǎng)期凍存后的復(fù)蘇活率,，從而有助于后續(xù)將干細(xì)胞用于疾病治療或創(chuàng)面修復(fù)等臨床應(yīng)用,。

本期,，我們以小鼠睪丸生精細(xì)胞凍存為例，來(lái)探究一下海藻糖在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用前景,。

不同凍存保護(hù)劑對(duì)未性成熟小鼠睪丸生精細(xì)胞凍存的影響

近些年,，隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的患者生育后代成為了可能,。在此過(guò)程中,，生殖相關(guān)細(xì)胞的長(zhǎng)期凍存成為了影響成功率的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)之一。

例如,，對(duì)于青春期前男性腫瘤患者,，性腺毒性治療可能會(huì)導(dǎo)致生育能力喪失，睪丸組織或細(xì)胞低溫長(zhǎng)期凍存是保存其生育力的重要手段,。

然而對(duì)于全身性腫瘤患者,，睪丸組織冷凍及復(fù)蘇后自體移植會(huì)帶來(lái)再次引入癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)?？紤]到睪丸細(xì)胞懸浮液可以進(jìn)行分選清除癌細(xì)胞,，而精原干細(xì)胞（SSC）可以在體外培養(yǎng),，誘導(dǎo)分化成圓形精子細(xì)胞，通過(guò)圓形精子細(xì)胞注射獲得后代,。

因此,，對(duì)于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細(xì)胞的長(zhǎng)期凍存是保存生育能力的重要途徑之一,，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值,。

來(lái)自鄭州大學(xué)人民醫(yī)院的張嘯龍等研究人員，采用兩周齡小鼠模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發(fā)育狀態(tài),，采用不同凍存方案對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞進(jìn)行低溫凍存,，探究最佳冷凍方案。

該研究根據(jù)凍存液組分不同,，分為以下5組：

組別

采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細(xì)胞懸液,，分裝，分別加入5組凍存保護(hù)劑并轉(zhuǎn)移至凍存管中,。將凍存管進(jìn)行程序化冷凍,，2個(gè)月后從液氮中取出，復(fù)蘇,，檢測(cè)細(xì)胞活率,、凋亡率、線粒體膜電位等,。

①凍存前后細(xì)胞活率及復(fù)蘇率

與凍存前比較,，5組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凍存復(fù)蘇后活率均有所下降。其中E組細(xì)胞活率及復(fù)蘇率顯著高于其余4組,。

②凍存后細(xì)胞恢復(fù)情況

以每組4mg睪丸組織解離凍存后實(shí)際回收的活細(xì)胞數(shù),，對(duì)睪丸細(xì)胞凍存復(fù)蘇后進(jìn)行定量計(jì)算,。結(jié)果顯示E組細(xì)胞恢復(fù)數(shù)量顯著高于其他4組,。

③細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,，與對(duì)照組相比,，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均顯著增加。5組實(shí)驗(yàn)組中,，E組細(xì)胞凋亡率顯著低于其余4組,。

④線粒體膜電位

與對(duì)照組相比，凍存復(fù)蘇后5組實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體膜電位均顯著下降,，其中E組下降程度低,，顯著低于其余4組。

冷凍保護(hù)劑可分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑,，非滲透性保護(hù)劑中,，常用的是蔗糖和海藻糖,。此前有研究顯示，向冷凍保護(hù)劑中添加蔗糖或海藻糖,，可顯著提高恒河猴或小鼠的睪丸細(xì)胞復(fù)蘇活率,。

該研究結(jié)果顯示，冷凍保護(hù)劑中添加0.1mol/L蔗糖或0.1mol/L海藻糖對(duì)細(xì)胞低溫冷凍均具有一定的保護(hù)作用,，而同時(shí)添加0.1mol/L蔗糖和0.1mol/L海藻糖可顯著提高小鼠睪丸生精細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后的活率,，降低細(xì)胞凋亡率，并降低低溫凍存對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的損傷,。

但較高的DMSO濃度（15%）產(chǎn)生的細(xì)胞毒性會(huì)部分抵消蔗糖和海藻糖的冷凍保護(hù)作用,。