摘要：近在SARS-CoV-2臨床試驗中mRNA疫苗的成功應用一部分歸功于納米顆粒脂質體遞送系統(tǒng)的開發(fā),，該系統(tǒng)不*在肌肉注射后有效表達mRNA編碼的免疫原,，而且作為佐劑和疫苗反應發(fā)揮作用,。我們概述了mRNA遞送系統(tǒng),，并重點介紹了目前SARS-CoV-2疫苗臨床試驗中使用的納米顆粒脂質體,。這篇綜述文末分析了基因疫苗中納米顆粒脂質體性能的決定因素,。

簡介

由于COVID-19在全球的大流行,，mRNA疫苗被推到了生物技術和制藥工業(yè)的中心舞臺。由BioNTech/輝瑞,、Moderna,、CureVac、Sanofi/TranslateBio,、Arcturus/Duke-NUS新加坡醫(yī)學院,、倫敦帝國理工學院,、泰國朱拉隆功大學和Providence Therapeutics領導的mRNA疫苗人體試驗共有8個正在進行。

值得注意的是,，其中兩項試驗已經公布了3期臨床中期結果,，報告了接種2次30 µg或100 µg劑量LNP包裹的編碼刺突蛋白免疫原的mRNA序列后，病毒感ran率降低94%以上,。疫苗開發(fā)的速度也遠超出了預期,，在SARS-CoV-2序列*公開后10個月就有了如此**的效果。這一成功不*證明了生物技術和制藥業(yè)有應對緊急和緊缺的全球性需求的能力,，也證明了mRNA作為一種藥物的所具有的能力,，在中mRNA作為一種預防性疫苗。本綜述的目的是概述mRNA遞送系統(tǒng)的發(fā)展,、總結SARS-CoV-2 mRNA疫苗的臨床前和臨床發(fā)現(xiàn),，并將其與其成功的遞送系統(tǒng)特征聯(lián)系起來。近有幾篇早于爆發(fā)的關于疫苗和zhi療mRNA遞送系統(tǒng)的的優(yōu)綜述已經發(fā)表,。

與小分子,、DNA、寡核苷酸,、病毒系統(tǒng)和蛋白質,，包括抗體等的其他藥物形式相比，mRNA療法具有許多優(yōu)勢和幾個難點,。與寡核苷酸和大多數(shù)小分子藥物有限的靶點相比,，mRNA可以調節(jié)刺激和抑制作用方式，也能夠表達或替換缺陷蛋白,，這擴大了其使用的潛在適應癥范圍,。

與DNA相比，mRNA只需要獲得細胞質的核糖體翻譯機制而不用進入細胞核,，因此沒有整合到人體基因組的風險,。與蛋白質和病毒系統(tǒng)相比,，mRNA的制造是在細胞外快速制備的,，并且蛋白質產物具有天然的糖基化和構象性質。當與脂質納米顆粒(LNP)遞送系統(tǒng)結合時,，mRNA LNP的納米結構特性也與病毒系統(tǒng)和循環(huán)的內源性含脂質乳糜微粒的大小,、脂質包膜和內部基因組物質等方面具有相似性，并且有助于其作為疫苗和其他zhi療藥物的遞送載體材料,。

mRNA的難點在于其先天的免疫原性,，對酶降解的敏感性以及細胞對裸露的mRNA攝取幾乎可以忽略不計。mRNA的先天免疫原性是由于toll樣受體(TLRs),、解旋酶受體(包括視黃酸誘導基因I (RIG-I)樣受體(RLRs)等)對單鏈和雙鏈RNA的識別,，然后這些受體通過NF-κB和干擾素(IFN)調節(jié)因子IRF3和IRF7發(fā)出信號并轉位到細胞核,，與I型IFN基因啟動子結合，誘導I型IFN(IFN-α和IFN-β)的表達,，并伴有促炎細胞因子產生,，如**壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-12（IL-12）,。分泌的干擾素作為一種病毒防御機制,，通過其受體和同一細胞及相鄰細胞中的JAK/STAT途徑發(fā)出信號，**300多個受干擾素刺激的基因,，包括蛋白激酶PKR,。

雖然這種**可能有利于對mRNA疫苗產生免疫反應，但直接作用是通過eIF2a的PKR磷酸化來下調翻譯,，這樣損害了eIF2的活性,，抑制了mRNA翻譯，從而抑制了免疫原的蛋白質合成,。消除這種先天免疫反應的主要方法是將天然存在的核苷如1-甲基二脲苷和核糖體RNA(通常不在mRNA中)中存在的其他核苷替換到mRNA序列中,，這使得它不能被先天免疫傳感器檢測到。這種核苷修飾的免疫應答mRNA是mRNA技術的基礎,，該技術近在BioNTech/輝瑞和Moderna疫苗試驗中顯示了超過94%的有效性,，這些技術是建立在對其他病原體試驗的基礎上，下文將詳細描述,。

由于TLR7和TLR8主要識別富含GU的單鏈RNA序列,，CureVac采用了第二種方法包括密碼子優(yōu)化和盡量不使用鳥苷酸。mRNAzhi療的第二個難點是其對核酸酶的敏感性,，例如在它血清中的半衰期< 5分鐘,。盡管siRNA的化學修飾在提高穩(wěn)定性和降低免疫原性方面非常成功，但迄今為止,，由于翻譯機制對化學修飾的敏感性,，使得它們在mRNA修飾并不成功。mRNA的第三個難點是大多數(shù)細胞類型（除不成熟的樹突細胞外）缺乏對裸露的mRNA的細胞攝取吸收,。

后兩個難點可以通過將核苷修飾或mRNA導入適宜遞送系統(tǒng)來解決,，這樣既保護mRNA免受核酸酶的攻擊，又促進細胞攝取,。比如,，當在動物模型中給藥時，與裸露的mRNA相比,，加入納米顆粒脂質體可保護mRNA免受核酸酶的攻擊,，并增強細胞攝取和表達高達1000倍。

質粒DNA主鏈通過體外轉錄(IVT)產生zhi療性mRNA,，其帶有5’端的帽子結構,、5’端的非翻譯區(qū)(UTR),、編碼目的蛋白開放閱讀框、3’端UTR和polyA尾,。天然真核生物的5’端帽子(cap0)是一種倒置的7-甲基鳥苷(m7G),，通過5’-5’三磷酸鹽與mRNA的**個核苷酸相連。

Cap0保護內源性mRNA免受核酸酶攻擊,，參與核輸出,，與翻譯起始因子4結合，啟動蛋白質翻譯,。另外兩個5’端帽子結構被證實(帽子1和帽子2)在第二個或第三個核糖核苷酸上含有額外的甲基,，其免疫原性低于cap0(因此更佳)。目前常用的加帽方法包括共轉錄加帽,，產生具有高翻譯和低免疫原性的帽子1,。5’端UTR參與翻譯起始，包含一個Kozak序列以及一個非帽依賴翻譯的核糖體進入位點,。開放閱讀框之后是3’端UTR,，它影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質表達的持久性。polyA尾在大約100個殘基上編碼,，有助于啟動翻譯和延緩降解,。體外轉錄（IVT）生產的mRNA需要經過純化，以去除具有免疫原性的DNA和雙鏈RNA污染物,。

上述的mRNA可以是核苷修飾的,，也可以是未經核苷修飾的序列，但不能進行自我復制,。能夠復制的自擴增mRNA (samRNA)也正在進行臨床試驗測試,，其長度約為10 kb，由于它們有四個額外編碼的非結構基因,，包括一個RNA依賴的RNA聚合酶,，導致了細胞內的自復制，但由于缺乏結構基因,，不會產生感ran性粒子,。

samRNA不能被核苷修飾，因為這些修飾會干擾自身擴增,。在目前的臨床試驗中,，由于samRNA的擴增過程，其通常使用較低的劑量(1-10 µg),，而非擴增的mRNA則需使用30-100 µg。表1總結了目前所有上述類別在進行人體臨床測試的mRNA疫苗,。這些臨床試驗中的所有mRNA遞送系統(tǒng)都是納米顆粒脂質體,。

BioNTech/輝瑞LNP和Moderna LNP已經公開其確切方,，而其他一些公司尚未公開。其他產品很可能與Alnylam公司的 OnpattroTM產品相似(下文將進一步描述),，就像已經公開的產品,，可能都包含用的可電離脂質。雖然所用的特定可電離脂質可能未知,，但其常用種類可以從期刊和**出版物中了解,，如表1所示。

表1：目前在進行人體臨床測試采用納米顆粒脂質包裹的mRNA疫苗總結如下,。臨床試驗中的所有mRNA疫苗都使用納米顆粒脂質體進行遞送,。其類別和組成尚未公開，因此基于現(xiàn)有文獻和**,，它們可能的類別如下所示,。

在之前，mRNA疫苗用于傳染病的臨床前和臨床研究,，包括流感,、寨卡病毒、艾zi病毒,、埃博拉病毒,、狂犬病、基孔肯雅病毒,、瘧疾,、生殖器皰疹、弓形蟲等,。這些研究被總結在近的一些綜述中,。

COVID-19

SARS-CoV-2

LNP：脂質納米顆粒

CNE:陽離子納米乳劑

NLC納米結構脂質載體

PBAE：聚β氨基酯

PACE：聚(胺-共-酯)

Epo

hPBAE：超支化聚β-氨基酯

PEI：聚乙烯亞胺

pABOL：二硫化物連接的聚酰胺基胺

SPLP：質粒-脂質顆粒

SNALP：核酸脂質顆粒

IFN：干擾素

HAI：血凝抑制試驗

CVnCoV：CureVac mRNA LNP

mAbs：單克隆抗體

VHH:Vh結構域

M2e:基質蛋白2外域

Tfh：濾泡輔助T細胞

本文文獻的參考文獻格式：

Michael D. B;Manuel J. C;Suman A;Mikell P；Mohamad G A;Drew W. Nanomaterial Delivery Systems for mRNA Vaccines. Vaccines 2021, 9, 65