體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗常見問題與解答
—熱點問題—
第一題 細胞被“黑膠蟲"污染了該如何處理,？
如果培養(yǎng)的細胞被“黑膠蟲"污染，需先去評估污染的嚴重程度,。如果污染不嚴重,，可選用市售的“黑膠蟲"清除試劑進行處理；如果污染較嚴重,，建議直接丟棄該細胞,，分析造成“黑膠蟲"污染的原因并進行治理。
第二題 CHL細胞為試驗系統(tǒng),，細胞準備時推薦的接種密度是多大,？接種后培養(yǎng)多久可以開始染毒？
本公司使用T25瓶進行試驗,，接種密度為6~9×10^4/mL,，接種量為5mL，即每瓶細胞量是3×10^5個~4.5×10^5個,。一般情況下,，接種后24h左右細胞的融合率可達到80%即可進行染毒，如果融合率不夠,，也可以繼續(xù)培養(yǎng)直至滿足試驗需求,。
第三題 一般如何確定秋水仙素的濃度和處理時間啊,？
秋水仙素劑量大,，則作用時間短,；秋水仙素劑量小,，則適當延長作用時間,。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL，4h,。
第四題 秋水仙素工作的機理是什么,？
秋水仙素可以抑制紡錘體的形成，導(dǎo)致紡錘絲無法捕捉到著絲粒而造成染色體不能向細胞兩極移動,。同時,，秋水仙素處理后，染色體將會不能排列在赤道板,，所以在細胞中會散亂分布,。
第五題 細胞收集量少是什么原因?qū)е碌模咳绾蝺?yōu)化,？
細胞收集量少的原因主要有以下幾點：
（1）酶消化過程消化不干凈,；
（2）離心速度過低，細胞不能沉淀,，導(dǎo)致細胞丟失,；
（3）鋪板細胞量不夠；
（4）樣品對細胞有毒性,，細胞死亡,。
優(yōu)化策略：
（1）酶消化過程需于顯微鏡下觀察，確保消化完,；
（2）適宜的離心條件,，通常250g，5min;
（3）細胞懸液需混合均勻,，必要時多次計數(shù),；
（4）如有需求，請于正式試驗前開展預(yù)試驗,。
第六題 低滲目的是什么,？有什么注意事項？
在低滲環(huán)境中,，細胞易吸水膨脹,，染色體鋪展，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態(tài),，為后續(xù)染色做準備,。在低滲過程中我們需要注意以下幾點：
（1）低滲時間。低滲時間過長,，可引起細胞破裂,，染色體丟失,；低滲時間不足，細胞膨脹度不夠,，染色體聚集,，分散不好，不利于閱片,。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯化甲溶液37℃水浴30~40min,。
（2） 細胞操作需輕柔。低滲后的細胞會脹大,，通透性增強,，細胞操作過程一定要輕柔，以防細胞破裂,。
（3）離心條件需適合,。低滲后細胞膨脹，離心力過高,，細胞容易破裂,，導(dǎo)致染色體丟失；離心力過低,，細胞不能沉淀,，收集不到細胞。
第七題 細胞在固定過程中丟失是什么原因?qū)е碌模?/span>
細胞在固定過程中丟失可能是因為離心速度過低,，細胞不能沉淀或沉淀不夠,，在更換固定液的過程中導(dǎo)致細胞丟失。
第八題 每次固定的時間是多久,？固定幾次比較合適,？
本公司使用的是預(yù)固定加重復(fù)固定的方法。預(yù)固定在低滲結(jié)束前進行,，一般3~5min,，步驟雖簡單卻不能省略，可有效預(yù)防細胞因加入大量的固定液而凝結(jié)成塊,。固定步驟共重復(fù)3次,，一般30±5min。
第九題 玻片干燥怎么操作,？
可于室溫下自然干燥,，也可于37℃干燥箱中烘干。
第十題 使用吉姆薩染液同樣條件下染片,，為什么會出現(xiàn)有的片子是藍色的,，有的是紅色的？
根本原因是因為染色過程中pH的變化,。吉姆薩染液由天青,，伊紅組成,，所帶電荷隨溶液PH而定。在偏酸性環(huán)境中下在電荷增多易與伊紅結(jié)合染色偏紅,；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多,易與美藍或天青結(jié)合,染色偏藍,。
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